111 年 國立成功大學分子醫學研究所《分子生物學》

此題考驗學生對細菌指數生長（exponential growth）的理解。細菌的生長遵循指數定律，其細胞數量的增加與時間呈指數關係。

解題步驟：

1. 確定總生長時間： 題目給定總時間為 3 小時。
2. 將總生長時間轉換為細胞倍增單位： 細菌的倍增時間（doubling time）為 30 分鐘。3 小時等於 $3 \times 60 = 180$ 分鐘。

核心觀念

本題考查利用基因間的重組頻率判定染色體上的基因順序。

重組頻率定義為：

$$\text{重組頻率}=\frac{\text{重組型後代數}}{\text{後代總數}}\times 100\%$$

在基因距離較近時，重組頻率可近似表示基因間的遺傳圖距；兩段相鄰區間的距離約可相加。因此：

• 重組頻率最小的基因彼此最接近。
• 若某基因位於另外兩基因之間，兩端基因的距離約等於兩段區間距離之和。

已知：

• $a-d=3\%$
• $c-d=6\%$
• $b-c=7\%$
• $a-c=10\%$
• $b-d=14\%$

解題方法

最小的重組頻率是 $a-d=3\%$，表示 $a$ 與 $d$ 最接近，兩者應為相鄰基因。

接著檢查 $c$ 的位置：

$$a-d+c \text{ 的距離}\approx a-d+d-c=3+6=9\%$$

題目給出的 $a-c=10\%$，與 $9\%$ 接近，因此表示 $d$ 位於 $a$ 與 $c$ 之間：

$$a-d-c$$

再檢查 $b$ 的位置：

$$d-c+b \text{ 的距離}\approx d-c+c-b=6+7=13\%$$

題目給出的 $b-d=14\%$，與 $13\%$ 接近，因此表示 $c$ 位於 $d$ 與 $b$ 之間：

$$a-d-c-b$$

所以基因順序為：

$$\boxed{a-d-c-b}$$

題目中的數值存在約 $1\%$ 的差異，可視為重組頻率四捨五入、雙交換造成的非完全可加性，並不影響基因順序判定。

選項分析

(A) a-b-d-c

此題考驗學生對蛋白質分子量與胺基酸數量的基本關係的理解。蛋白質的分子量主要由組成它的胺基酸的分子量總和決定。

解題步驟：

1. 確定平均胺基酸分子量： 蛋白質由 20 種標準胺基酸組成。在形成胜肽鍵時，每形成一個胜肽鍵，會脫去一個水分子（分子量約為 18 Da）。因此，每加入一個胺基酸到胜肽鏈中，其平均分子量貢獻略低於其游離狀態的分子量。一個常用的平均值是每個胺基酸殘基（amino acid residue）約為 110 Da。

此題考驗學生對 DNA 分子量與鹼基對數量的關係的理解。

解題步驟：

1. 確定 DNA 基本單位的平均分子量： DNA 是由核苷酸組成的雙股螺旋結構。每個核苷酸包含一個磷酸基、一個去氧核糖和一個含氮鹼基。在雙股 DNA 中，我們通常關心的是鹼基對（base pair, bp）的長度。
   • 一對鹼基（例如 A-T 或 G-C）的平均分子量約為 660 Da。這個數值是基於磷酸 (約 97 Da) + 去氧核糖 (約 150 Da) + 平均鹼基 (約 313 Da, (A+T)/2 = 121+111/2, (G+C)/2 = 151+112/2) 的平均值。更精確的計算通常使用 660 Da/bp 作為平均值。

此題考驗學生對 DNA 雙股結構中鹼基配對規則（Chargaff's rules）的理解。

解題步驟：

1. 回顧 Chargaff's rules： 在雙股 DNA 中，腺嘌呤（Adenine, A）的數量總是等於胸腺嘧啶（Thymine, T）的數量，即 $A = T$。同樣地，鳥糞嘌呤（Guanine, G）的數量總是等於胞嘧啶（Cytosine, C）的數量，即 $G = C$。
2. 理解總鹼基百分比： 總共有四種鹼基：A、T、G、C。它們的總百分比為 100%。
   • $A + T + G + C = 100\%$
3. 應用 Chargaff's rules： 由於 $A = T$ 且 $G = C$，我們可以將公式改寫為：
   • $2A + 2G = 100\%$
   • 或者 $A + G = 50\%$

此題考驗學生對轉位子（transposons）的理解，特別是關於其結構、功能和轉位機制。需要判斷哪個敘述是錯誤的。

解題步驟：

1. 分析選項 (A)： 插入序列（Insertion Sequences, IS elements）是結構最簡單的轉位子，僅包含轉位所需的基因（通常是轉位酶，transposase）和兩端的重複序列。此敘述正確。
2. 分析選項 (B)： 轉位子通常具有在其自身的末端存在的重複序列。這些重複序列可以是直接重複（Direct Repeats, DR）或反向末端重複（Inverted Terminal Repeats, ITR）。在轉位過程中，轉位子會插入目標 DNA 中，並在目標 DNA 的插入位點周圍產生短的直接重複序列。然而，轉位子自身通常具有反向末端重複（ITR），這些 ITR 在識別和切割 DNA 時起作用，但它們不會在目標 DNA 的兩側產生反向末端重複。目標 DNA 的兩側會產生直接重複。

此題考驗學生對 RNA 剪接（splicing）和催化性 RNA（catalytic RNA）的理解，特別是關於 Group I 和 Group II 內含子（introns）的特性，以及 RNA 編輯（RNA editing）。需要判斷哪個敘述是錯誤的。

解題步驟：

1. 分析選項 (A)： Group I 內含子是一類可以進行自我剪接（self-splicing）的 RNA。它們利用鳥糞嘌呤（G）作為輔因子，通過一系列的轉酯化反應（transesterification）來催化自身的剪接。此敘述正確。
2. 分析選項 (B)： 某些 Group I 內含子具有移動性，它們可以編碼產生內切核酸酶（endonucleases），這些酶能夠切割宿主 DNA 或 RNA，促進內含子的移動（mobility）。這種機制與轉座子類似，稱為「RNA 介導的內含子移動」（RNA-mediated intron mobility）。此敘述正確。
3. 分析選項 (C)： Group II 內含子與 Group I 內含子一樣，也可以自我剪接。

核心觀念

1. 真核生物基因結構（Eukaryotic Gene Structure）：真核生物多數蛋白質編碼基因屬於「斷裂基因（Split genes）」，其編碼序列由**外顯子（Exons）與非編碼的內含子（Introns）**交錯排列組成。
2. RNA 剪接（RNA Splicing）：初級轉錄本（pre-mRNA）在細胞核中經過剪接作用（splicing），移除所有內含子並將外顯子依序接合，形成成熟 mRNA（mature mRNA）。
3. R-loop 雜交分析（R-loop Hybridization Mapping）：1977 年 Phillip Sharp 與 Richard Roberts 團隊利用核酸雜交與電子顯微鏡觀察，證實真核生物基因存在內含子的經典實驗。

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解題方法

1. 比較分子結構組成：
   • 染色體 DNA（Chromosomal DNA）：包含未經修飾的完整基因序列，即包含「外顯子＋內含子」。
   • 成熟 mRNA（Mature mRNA）：經由轉錄後修飾（Post-transcriptional modification），已完全剔除「內含子」，僅保留「外顯子」。
2. 推導分子雜交（Hybridization）行為：
   • 將變性為單股的染色體 DNA 與成熟 mRNA 混合並進行分子雜交時，mRNA 上的外顯子序列會精準地與 DNA 模板股上對應的外顯子序列進行鹼基互補配對，形成穩定的 RNA-DNA 雜交雙股（hybrid duplex）。
   • 夾在外顯子之間的 DNA 內含子序列，因成熟 mRNA 上已無相對應的互補序列可供配對，無法形成雙股結構，於是在雜交區域向外折疊隆起，形成肉眼或電顯下可觀察到的單股 DNA 凸出環（single-stranded DNA loops）。

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核心觀念

本題考查真核生物前信使 RNA（pre-mRNA）的三大加工：

1. 5′端加帽（5′ capping）
2. RNA 剪接（splicing）
3. 3′端切割與多聚腺苷酸化（polyadenylation）

其中，5′端帽的正確名稱是 7-甲基鳥嘌呤（7-methylguanosine，m⁷G），以特殊的 $5′$–$5′$ 三磷酸鍵連接在 RNA 的 $5′$ 端。

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解題方法

逐一檢查各選項是否符合真核生物 mRNA 加工的時間順序與分子機制：

• 新生 RNA 的 $5′$ 端會先加上帽結構。
• RNA 聚合酶 II 通過 poly(A) signal 後，前信使 RNA 在 poly(A) site 被切割。
• 切割後，於新的 $3′$ 端添加一串腺苷酸，形成 poly(A) tail。
• RNA 剪接常在轉錄進行期間同步發生，實際先後順序會受到基因長度與內含子數量影響。
• 比較帽結構的化學名稱，即可判斷錯誤選項。

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選項分析

(A) The 5' end of the nascent RNA is capped with 5-methylguanylate

錯誤。

新生 RNA 的 $5′$ 端確實會加帽，但帽的核心結構不是 5-methylguanylate，而是 7-methylguanylate（$m^7$G），即鳥嘌呤的第 7 位氮原子被甲基化。

典型帽結構可表示為：

$$m^7GpppN$$

其中 $m^7G$ 是 7-甲基鳥嘌呤，$ppp$ 代表 $5′$–$5′$ 三磷酸連接，$N$ 是第一個 RNA 核苷酸。因此，選項將「7-甲基」誤寫成「5-甲基」，敘述不正確。

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(B) Termination occurs at any one of multiple termination sites downstream from the poly A site.

正確。

真核生物 RNA 聚合酶 II 的轉錄終止通常不是發生在 poly(A) site 本身。前信使 RNA 先在 poly(A) site 附近被切割，接著加上 poly(A) tail；RNA 聚合酶則繼續向下游轉錄一段距離，最後在多個下游終止位置中的一處終止。

因此，poly(A) site 與真正的轉錄終止位置並不相同。

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此題考驗學生對真核生物啟動子（promoter）結構和功能的理解。需要判斷哪個敘述是錯誤的。

解題步驟：

1. 分析選項 (A)： 啟動子（promoter）通常位於基因的上游（upstream）。然而，核心啟動子（core promoter）包含轉錄起始位點（transcription start site, TSS），而 TSS 本身就是啟動子的一部分。有些核心啟動子元件，如哺乳動物的 Initiator (Inr) 和下游啟動子元素 (downstream promoter elements, DPE)，確實位於 TSS 的下游。此敘述正確。
2. 分析選項 (B)： 啟動子區域包含多個重要元件，包括 RNA 聚合酶（RNA polymerase）的結合位點（或其輔助因子 TFIID 的結合位點，如 TATA box），轉錄起始位點，以及增強子（enhancer）、沉默子（silencer）等順式作用序列（cis-regulatory sequences），這些序列調節轉錄的效率和時機。此敘述正確。
3. 分析選項 (C)： TATA box 是一個常見的核心啟動子元件，通常位於轉錄起始位點（TSS）上游約 25-30 個鹼基對處。然而，題目中提到的是「translation start site」（翻譯起始位點，通常是 ATG）。TSS 和翻譯起始位點（AUG）通常是不同的。

此題要求定義「無義介導的 mRNA 降解」（Nonsense-Mediated mRNA Decay, NMD）。

Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) 是一種重要的細胞內品質控制機制，用於識別和降解含有過早終止密碼子（premature termination codon, PTC）的 mRNA 分子。

核心概念：

1. 目標： 含有 PTC 的 mRNA。PTC 是指在正常情況下，mRNA 應該在終止密碼子（stop codon）處終止翻譯，但由於突變或其他原因，提前出現了一個終止密碼子。
2. 機制： NMD 系統通過識別與 mRNA 結合的特定蛋白質複合體來區分「正常」的終止密碼子和「過早」的終止密碼子。一個關鍵的標記是，在真核生物中，成熟的 mRNA 在其 5' 端附近會保留一個稱為「了嗎」（Exon Junction Complex, EJC）的蛋白質複合體，這個複合體在第一次核糖體掃描（ribosomal scanning）經過它時會被移除。

此題要求定義「順式作用元件」（Cis-acting element）。

順式作用元件 (Cis-acting element) 是指在基因調控中，位於目標基因同一條 DNA 分子（染色體）上的 DNA 序列。這些序列本身不編碼蛋白質，但它們是細胞核內調控蛋白質（如轉錄因子）的結合位點，從而影響其自身所在基因的轉錄、複製或其他基因功能。

核心概念：

1. 位置： 必須與被調控的基因位於同一條 DNA 分子上。這與反式作用因子（trans-acting factors，通常是可溶性蛋白質）相對，反式作用因子可以從基因組的其他地方編碼，然後擴散到目標基因處結合。
2. 性質： 順式作用元件本身是 DNA 序列，它們不產生蛋白質或 RNA 分子，而是作為調控蛋白質的「停泊點」或「信號」。
3. 功能： 它們在基因表達的調控中起關鍵作用，例如：
   • 啟動子 (Promoter)： 包含 RNA 聚合酶結合位點和轉錄起始位點，是轉錄開始的必要區域。

此題要求定義「Z-DNA」。

Z-DNA 是一種非典型的 DNA 雙螺旋結構，與我們最熟悉的 B-DNA 結構不同。它呈現出左手螺旋（left-handed helix）的特徵，這也是其名稱「Z」的由來。

核心特徵：

1. 螺旋方向： Z-DNA 是左手螺旋，而 B-DNA 是右手螺旋。
2. 結構： Z-DNA 的雙螺旋結構比較狹窄且細長，其骨架呈鋸齒狀（zigzag）排列，這也是其名稱「Z」的另一個可能來源（與鋸齒狀的 Z 相似）。
3. 鹼基配對： Z-DNA 仍然遵循沃森-克里克鹼基配對規則（A-T, G-C）。
4. 核苷酸構象： Z-DNA 中的脫氧核糖核苷酸通常處於反式（anti）構象，但 GC 序列的鳥糞嘌呤（G）可以處於順式（syn）構象。這種構象的變化是形成 Z-DNA 的關鍵。
5. 序列偏好性： Z-DNA 的形成對 DNA 序列有較強的偏好性。

此題要求定義「多順位 mRNA」（Polycistronic mRNA）。

多順位 mRNA (Polycistronic mRNA) 是指一個單一的 mRNA 分子，它包含多個獨立的編碼區（cistrons 或 open reading frames, ORFs），每個編碼區都可以被翻譯成一個獨立的蛋白質。

核心概念：

1. 編碼區數量： 一個 mRNA 分子編碼一個以上的蛋白質。
2. 起始與終止： 每個編碼區都有自己的起始密碼子（如 AUG）和終止密碼子（如 UAA, UAG, UGA）。
3. 核糖體結合位點： 每個編碼區通常會有一個獨立的核糖體結合位點（ribosome binding site, RBS），允許核糖體獨立地結合到該編碼區並開始翻譯。
4. 出現地點： 多順位 mRNA 主要存在於原核生物（如細菌）中。

此題要求定義「噬斑分析法」（Plaque Assay）。

噬斑分析法 (Plaque Assay) 是一種用於定量檢測和分離具有感染性病毒（尤其是噬菌體，bacteriophages）的技術。通過在含有宿主細胞的培養基上培養病毒，病毒會感染細胞並在其周圍形成一個清晰的區域，稱為「噬斑」（plaque）。

核心概念：

1. 應用對象： 主要用於檢測和定量病毒，特別是噬菌體（感染細菌的病毒）。
2. 原理：
   • 將一定稀釋度的病毒懸液與宿主細胞（如細菌）混合。
   • 將混合物鋪在含有營養培養基的平板上（通常是固體或半固體培養基）。
   • 病毒感染宿主細胞，並在細胞內複製。
   • 感染後的細胞破裂（裂解，lysis），釋放出新的病毒顆粒。
   • 這些新的病毒顆粒會感染周圍的細胞，形成一個不斷擴大的感染區域。

此題要求解釋 EMSA 的定義。

EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)，中文稱為「電泳遷移率變動分析」或「凝膠遷移率變動分析」，是一種分子生物學技術，用於檢測 DNA 或 RNA 與蛋白質之間是否存在結合。

核心原理：

1. 基本原理： EMSA 的核心是利用電泳來分離不同大小和電荷的分子。當一個帶電分子（如 DNA 或 RNA）與一個蛋白質結合時，形成的蛋白質-核酸複合體會比單獨的 DNA 或 RNA 分子具有更大的分子量和可能不同的電荷分佈。
2. 實驗步驟：
   • 準備樣品： 準備帶有標記（如放射性同位素或螢光標記）的 DNA 或 RNA 探針（probe）。
   • 混合： 將探針與含有潛在結合蛋白質的樣品（如細胞裂解液、純化蛋白質）在適當的緩衝條件下混合。
   • 電泳： 將混合後的樣品進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳（native PAGE）。這種電泳不會破壞蛋白質-核酸的結合。

此題要求描述兩種產生核酸探針（nucleotide probes）的方法。在 EMSA 等實驗中，探針是實驗的關鍵組件，需要具有特定的序列和標記。

產生核酸探針（DNA 或 RNA）的方法有多種，以下介紹兩種常見且詳細的方法：

方法一：PCR 擴增並進行體外標記 (PCR Amplification followed by In Vitro Labeling)

這是目前最常用、最靈活的方法之一，可以產生 DNA 或 RNA 探針。

1. 目標序列的 PCR 擴增：

   • 設計引物 (Primers)： 根據目標 5'UTR 序列（或其預測的結構域），設計特異性的正向和反向引物。引物的長度通常在 18-25 個鹼基對，確保其特異性。
   • PCR 反應： 使用高保真度的 DNA 聚合酶（如 Taq polymerase 或 Pfu polymerase），在 PCR 儀器中進行擴增。反應體系包含引物、模板 DNA（病毒 RNA 經逆轉錄成的 cDNA，或病毒基因組 DNA）、dNTPs（標準的 A, T, C, G 核苷酸）和緩衝液。
   • 擴增產物： PCR 反應會產生目標序列的雙鏈 DNA 產物，長度精確。

2. 進行標記 (Labeling)： 擴增得到的 DNA 產物可以進一步進行標記。

   • 放射性標記 (Radiolabeling)：
     • 原理： 在 PCR 反應後期，或對 PCR 產物進行隨機引物標記 (random primer labeling) 或末端標記 (end-labeling) 時，加入放射性同位素標記的 dNTPs（如 $\alpha-^{32}P$-dATP, $\alpha-^{32}P$-dCTP 等）。
     • 方法：
       • 隨機引物標記： 使用隨機引物（長度約 6-9 個鹼基，隨機序列）在模板 DNA 上隨機起始合成互補鏈，並將放射性 dNTPs 摻入新合成的鏈中。
       • 末端標記： 使用 T4 DNA 聚合酶等，在 DNA 雙鏈的 3' 端添加放射性標記的 dNTPs。
     • 優點： 靈敏度高，易於檢測。
     • 缺點： 放射性物質有危險性，需要特殊處理和設備。
   • 非放射性標記 (Non-radioactive labeling)：
     • 原理： 在 PCR 反應或隨機引物標記反應中，用帶有螢光基團、生物素 (biotin)、地高辛 (digoxigenin) 等標記的 dNTPs 替代或部分替代標準 dNTPs。
     • 方法：
       • 摻入標記 dNTPs： 在 PCR 或標記反應中直接加入標記的 dNTPs。
       • 事後標記： 對 PCR 產物進行化學修飾，連接生物素或螢光基團。
     • 檢測：
       • 螢光標記：直接通過螢光檢測儀器檢測。
       • 生物素/地高辛標記：需要結合抗體（如抗生物素抗體、抗地高辛抗體）和酶（如辣根過氧化物酶 HRP、鹼性磷酸酶 AP），然後通過化學發光或顯色底物來檢測。
     • 優點： 安全，操作相對簡便，可進行多重標記和檢測。
     • 缺點： 靈敏度可能略低於放射性標記（取決於標記方式和檢測系統）。

方法二：體外轉錄合成 RNA 探針 (In Vitro Transcription to Synthesize RNA Probes)

如果需要 RNA 探針（例如用於 Northern blot 或原位雜交），則需要進行體外轉錄。

此題要求根據 EMSA 的實驗結果圖（雖然題目中提到有圖，但在此處無法顯示，需要基於一般 EMSA 結果的判讀來推斷）來描述科學家的發現。由於沒有實際的圖，我將基於 EMSA 結果圖的標準判讀方式來推測可能的發現。

假設的 EMSA 結果圖描述：
通常，EMSA 圖譜會顯示多個泳道，代表不同的實驗條件。

• 泳道 1 (對照)： 只包含核酸探針（如 5'UTR 的某個片段或結構域），沒有蛋白質 X。探針會移動到一個較低的位置。
• 泳道 2-7 (實驗組)： 包含核酸探針和不同濃度的蛋白質 X，或者包含不同的核酸探針（如結構域 I 到 VI）與蛋白質 X。
• 觀察到的現象： 在某些泳道中，探針的移動會被「上移」（shifted），形成一個或多個新的、移動較慢的條帶，這代表蛋白質 X 與該探針結合。這種上移通常會隨著蛋白質 X 濃度的增加而更明顯（如果測試不同濃度的蛋白質），或者在測試不同的探針時，某些探針會發生上移而另一些則不會。

基於上述假設的 EMSA 結果，科學家可能的發現會是：

1. 蛋白質 X 與 5'UTR 的某些特定區域結合：
   • 如果科學家測試了 6 個不同的探針（對應於結構域 I 到 VI），並且只有其中幾個（例如，結構域 II 和 V）顯示出明顯的移動變動（shift），那麼他的發現是蛋白質 X 特異性地結合到 5'UTR 的結構域 II 和 V，而不是結合到其他結構域。

此題要求解釋 IRES 的含義，以及如果蛋白質 X 結合的區域是 IRES，那麼蛋白質 X 的功能相關性是什麼。

1. IRES 是什麼？

IRES (Internal Ribosome Entry Site)，中文稱為「內部核糖體進入位點」，是一種特殊的 RNA 序列結構，存在於某些病毒 mRNA（特別是 RNA 病毒）和少數真核生物 mRNA 的 5' 非翻譯區（5' UTR）中。

• 功能： 與大多數真核生物 mRNA 需要 5' 帽結構來招募核糖體（帽子依賴性翻譯, cap-dependent translation）不同，IRES 允許核糖體直接結合到 mRNA 的內部位點，繞過 5' 帽結構，從而啟動翻譯。
• 重要性： IRES 在病毒的複製和表達中至關重要。許多 RNA 病毒的基因組是單順位的（monocistronic）或多順位的（polycistronic），但它們的 mRNA 通常沒有 5' 帽結構（因為它們是從 RNA 模板直接轉錄而來，或依賴於病毒編碼的酶進行轉錄）。IRES 允許病毒 mRNA 在宿主細胞中進行翻譯，即使宿主細胞的 5' 帽依賴性翻譯機制被抑制。
• 結構： IRES 通常具有複雜的二級結構，能夠直接與核糖體小亞基（40S）的某些組分（如 40S 核糖體亞基、eIF1A、eIF3 等）以及其他 IRES 結合因子（IRES trans-acting factors, IATFs）相互作用。

2. 如果蛋白質 X 結合的區域是 IRES，那麼蛋白質 X 的功能相關性是什麼？

如果科學家發現蛋白質 X 結合的區域恰好是病毒 mRNA 的 IRES 區域，那麼蛋白質 X 的功能相關性可能包括以下幾點：

• 作為 IRES 結合因子（IRES trans-acting factor, IATF）： 蛋白質 X 可能是一種 IRES 結合因子，它直接結合到 IRES 區域，並協助核糖體小亞基（40S）或翻譯起始因子（如 eIFs）識別、結合 IRES，從而啟動翻譯。
  • 促進翻譯： 蛋白質 X 可能增強 IRES 的活性，促進病毒 mRNA 的翻譯效率，從而增加病毒蛋白質的合成，有利於病毒的複製。

此題要求解釋 RNA-seq 的核心分子生物學技術，並列出其關鍵所需材料。

RNA Sequencing (RNA-seq) 的核心技術：

RNA-seq 的核心技術是下一代定序 (Next-Generation Sequencing, NGS)，也稱為高通量定序 (High-Throughput Sequencing)。NGS 是一種大規模並行定序技術，能夠快速、經濟地對大量的 DNA 或 RNA 分子進行定序。

RNA-seq 的流程與關鍵技術：
RNA-seq 的基本流程包括：

1. RNA 提取與品質控制。
2. RNA 文庫製備 (Library Preparation)：
   • mRNA 富集或 rRNA 去除： 由於 mRNA 在總 RNA 中佔比較低，通常需要富集 mRNA（利用 poly-A 尾結合 Oigo(dT) 磁珠），或去除含量豐富的 rRNA。
   • RNA 打斷 (RNA Fragmentation)： 將長鏈 RNA 打斷成較短的片段，以適應定序平台的讀長限制。
   • 逆轉錄合成 cDNA (cDNA Synthesis)： 使用逆轉錄酶（reverse transcriptase）以 RNA 為模板合成互補的 DNA（cDNA）。這是 RNA-seq 的關鍵步驟，因為定序技術主要針對 DNA。
   • ** cDNA 雙鏈合成。**
   • ** cDNA 片段末端修飾與接上接頭 (End Repair, A-tailing, Adapter Ligation)：** 在 cDNA 片段的兩端加上定序接頭（adapters）。這些接頭包含用於 PCR 擴增和定序反應的序列，以及用於樣品識別的索引標籤（index/barcode）。
   • PCR 擴增文庫。
3. 高通量定序 (High-Throughput Sequencing)：
   • 將製備好的 cDNA 文庫載入到定序儀器（如 Illumina 平台）上進行定序。
   • 定序儀通過偵測每個 DNA 片段的鹼基序列，產生大量的短讀長（short reads）的序列數據。
4. 生物資訊學分析 (Bioinformatics Analysis)：
   • 序列比對 (Read Alignment)： 將定序產生的短讀長與參考基因組或轉錄組進行比對。
   • 定量分析 (Quantification)： 計算每個基因或轉錄本的表達水平（如 FPKM, RPKM, TPM 等）。
   • 差異表達分析 (Differential Expression Analysis)： 比較不同樣本間的基因表達差異。
   • 其他分析： 如可變剪接分析、新轉錄本發現等。

關鍵所需材料（用於文庫製備和定序）：

1. RNA 樣品： 高品質的總 RNA 或 mRNA。
2. 逆轉錄酶 (Reverse Transcriptase)： 將 RNA 轉錄成 cDNA。

此題要求列舉兩種非蛋白質編碼 RNA (non-coding RNA, ncRNA) 的類別，並分別說明它們調控基因表達的機制。

非蛋白質編碼 RNA (ncRNA) 的重要性：
儘管基因組中只有約 1-2% 編碼蛋白質，但大量的基因（高達 98%）轉錄出的 RNA 並不翻譯成蛋白質，而是發揮各種調控功能。這些 ncRNA 在基因表達的各個層面（從染色質結構到轉錄、轉譯後修飾和 mRNA 降解）都扮演著關鍵角色。

以下列舉兩種主要的 ncRNA 類別及其調控機制：

類別一：微 RNA (microRNA, miRNA)

1. miRNA 的性質： miRNA 是一類長度約 21-23 個核苷酸的短 ncRNA 分子。它們在轉錄後加工形成，並與蛋白質形成 RNA 誘導的沉默複合體（RISC）。
2. 調控機制： miRNA 主要通過兩種方式調控基因表達，這取決於其與靶標 mRNA 的序列互補程度：
   • mRNA 降解 (mRNA degradation)： 當 miRNA 與靶標 mRNA 的 3' 非翻譯區（3' UTR）之間存在近乎完美的序列互補時，RISC 複合體會引導靶標 mRNA 的切割和降解。這會導致靶標 mRNA 的數量減少，從而降低蛋白質的合成。
   • 翻譯抑制 (Translational repression)： 當 miRNA 與靶標 mRNA 的 3' UTR 之間存在不完全的序列互補時（常見於動物），RISC 複合體會結合到靶標 mRNA 上，阻礙核糖體結合或掃描，或抑制翻譯起始複合物的形成，從而抑制靶標 mRNA 的翻譯，即使 mRNA 本身沒有被降解。
3. 調控層面： 主要在轉譯後（post-transcriptional level）調控基因表達，通過影響 mRNA 的穩定性和翻譯效率。

類別二：長鏈非編碼 RNA (long non-coding RNA, lncRNA)

1. lncRNA 的性質： lncRNA 是長度大於 200 個核苷酸的 ncRNA 分子。它們的結構和功能高度多樣化。
2. 調控機制： lncRNA 可以通過多種機制調控基因表達，其作用層面非常廣泛：
   • 染色質重塑和表觀遺傳調控 (Chromatin remodeling and epigenetic regulation)：
     • 指導蛋白質複合體定位： lncRNA 可以作為「嚮導」（scaffolds）或「導航分子」，將蛋白質複合體（如 PRC2，包含 EZH2 酶，負責 H3K27 甲基化）招募到特定的基因座（loci），影響染色質的緊密度，從而關閉（silence）或激活基因。例如，Xist lncRNA 負責 X 染色體失活。
     • 影響 DNA 甲基化： lncRNA 可能參與 DNA 甲基化過程，進一步影響基因表達。
   • 轉錄調控 (Transcriptional regulation)：
     • 增強子/沉默子功能： lncRNA 可以作為增強子或沉默子的一部分，或與這些元件相互作用，調控下游基因的轉錄。
     • 調控轉錄因子活性： lncRNA 可以通過結合轉錄因子，影響其與 DNA 的結合能力或其活性。
   • mRNA 加工和穩定性調控 (mRNA processing and stability)：

此題要求使用表格比較「遺傳性改變」（genetic changes）與「表觀遺傳性改變」（epigenetic changes），並分別闡述它們對 DNA、RNA 和蛋白質的影響。

特徵/影響	遺傳性改變 (Genetic Changes)	表觀遺傳性改變 (Epigenetic Changes)
定義	指 DNA 序列本身的永久性或半永久性改變。	指在不改變 DNA 序列本身的情況下，對基因表達進行的調控。
基礎	DNA 鹼基序列的改變（突變、插入、刪除、重排）。	DNA 序列外部的化學修飾（如 DNA 甲基化、組蛋白修飾）或 RNA 調控。
可遺傳性	通常是永久性的，可通過細胞分裂傳遞給子細胞，也可通過生殖細胞傳遞給後代。	可通過細胞分裂傳遞（半永久性），但通常不如遺傳改變那樣穩定，且可逆。
可逆性	通常是不可逆的。	通常是可逆的。
對 DNA 的影響	改變 DNA 序列本身。 例如，一個 C-G 對變成了 A-T 對。	不改變 DNA 序列。 但會改變 DNA 的物理化學性質，如甲基化在 C5 位點添加甲基。
對 RNA 的影響	可能間接影響 RNA。 序列改變可能導致：<br>1. 轉錄產物改變（如外顯子突變影響剪接）。<br>2. 產物 RNA 序列不同（如點突變導致密碼子改變）。	直接或間接影響 RNA。 <br>1. 染色質結構改變： 影響基因的可及性，從而影響轉錄效率，改變 RNA 產量。<br>2. 調控 RNA 轉錄： lncRNA 可參與調控轉錄。<br>3. 影響 RNA 加工： lncRNA 可影響剪接。
對蛋白質的影響	直接且根本性地改變蛋白質。 <br>1. 序列改變： 突變可能導致胺基酸改變，影響蛋白質結構和功能。<br>2. 截短或缺失： 移碼突變或過早終止密碼子可能產生截短的蛋白質。<br>3. 無蛋白質產物： 嚴重的突變可能導致沒有蛋白質表達。	間接影響蛋白質。 <br>1. 改變蛋白質產量： 通過影響 mRNA 的轉錄或穩定性，改變蛋白質的合成量（增加或減少）。<br>2. 改變蛋白質的翻譯後修飾： 雖然不直接改變蛋白質序列，但可能影響蛋白質的功能。
範例	基因突變（如致病性突變）、染色體易位。	DNA 甲基化、組蛋白乙醯化/甲基化/磷酸化、miRNA 調控、lncRNA 調控。

詳細解釋：

1. 遺傳性改變 (Genetic Changes)：

• DNA 層面： 這是最基礎的改變，直接修改了 DNA 的鹼基序列。例如，一個基因中的一個鹼基發生了點突變 (point mutation)，或者一個較大的 DNA 片段發生了插入 (insertion)、刪除 (deletion) 或重排 (rearrangement)。這些改變是永久性的（除非有反向突變）。
• RNA 層面： DNA 序列的改變會直接影響轉錄產生的 RNA。如果突變發生在外顯子區域，可能影響 mRNA 的序列、剪接位點，進而產生序列不同的 mRNA。如果突變導致移碼或提前出現終止密碼子，則會產生截短的 mRNA。
• 蛋白質層面： 這是遺傳改變最直接和最根本的影響。DNA 序列的改變最終轉化為蛋白質胺基酸序列的改變。例如，一個點突變可能導致一個胺基酸被替換，進而影響蛋白質的三級結構和功能。移碼突變或提前終止密碼子則會產生截短的、通常無功能的蛋白質，甚至完全不產生蛋白質。

2. 表觀遺傳性改變 (Epigenetic Changes)：

• DNA 層面： 表觀遺傳改變不修改 DNA 的鹼基序列，而是通過在 DNA 分子或其結合的組蛋白上添加化學標記來影響基因的可及性。最常見的是 DNA 甲基化，通常發生在 CpG 二核苷酸的胞嘧嘧啶（C）的第 5 位碳上。這會增加 DNA 的負電荷，改變其與組蛋白的相互作用，使染色質變得更緊密，從而抑制基因轉錄。
• RNA 層面： 表觀遺傳改變可以通過多種方式影響 RNA。
  • 染色質結構改變： DNA 甲基化和組蛋白修飾（如乙醯化、甲基化）會改變染色質的緊密度。緊密的染色質（異染色質）通常不易被轉錄機器訪問，導致轉錄 RNA 的量減少；而疏鬆的染色質（常染色質）則更容易被訪問，轉錄 RNA 量增加。
  • 直接調控轉錄： 某些 lncRNA 本身就是表觀遺傳調控的一部分，它們可以招募調控蛋白質到基因組位點，直接影響轉錄。
• 蛋白質層面： 表觀遺傳改變主要通過影響 mRNA 的產生量來間接影響蛋白質。
  • 改變蛋白質產量： 如果一個基因的表觀遺傳沉默（如 DNA 甲基化導致染色質緊密化），則該基因的 mRNA 轉錄量會大大減少，最終導致合成的蛋白質數量減少。反之，表觀遺傳激活則會增加蛋白質產量。
  • 不改變蛋白質序列： 重要的是，表觀遺傳改變不會改變蛋白質的胺基酸序列，因此產生的蛋白質在結構上與正常情況相同，只是其「數量」發生了改變。

此題分為兩部分，第一部分要求定義 RNA 編輯及其對基因產物的影響；第二部分要求判斷關於 RNA 編輯的正確敘述。

第一部分：RNA 編輯的定義與影響

RNA 編輯 (RNA Editing)：
RNA 編輯是指在 RNA 分子轉錄完成後，通過特定的酶促反應，對 RNA 分子中的一個或多個核苷酸進行化學修飾或改變，從而改變其序列或結構的過程。這種改變是後轉錄的，不同於剪接（splicing）和加帽（capping）等修飾。

RNA 編輯對編輯基因產物的影響：
RNA 編輯最直接的影響是改變了原始 RNA 分子的序列，進而可能影響其功能。

• 改變蛋白質序列和功能： 如果編輯發生在編碼區（coding region）的 mRNA 上，它可能導致：
  • 密碼子改變： 一個編輯事件（如 A-to-I 或 C-to-U）可能將一個密碼子改變成另一個密碼子。
  • 胺基酸序列改變： 密碼子的改變直接導致翻譯生成的蛋白質胺基酸序列發生變化。這種變化可能：
    • 產生不同的蛋白質異構體 (isoforms)： 編輯後的蛋白質可能具有與未編輯蛋白質不同的功能、活性或定位。
    • 產生截短的蛋白質： 編輯可能在編碼區引入一個過早的終止密碼子，導致翻譯出截短的蛋白質。
    • 影響蛋白質的摺疊或穩定性。
• 改變非編碼 RNA 的功能： 如果編輯發生在非編碼 RNA（如 tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA）上，它也會改變這些 RNA 的結構和功能。例如：
  • tRNA 編輯： 可能影響 tRNA 的鹼基配對，進而影響其與密碼子的識別或與胺基酸的結合。
  • rRNA 編輯： 可能影響核糖體的結構和功能。
  • miRNA 編輯： 可能改變 miRNA 與靶標 mRNA 的結合能力，影響其調控功能。
  • lncRNA 編輯： 可能改變其與蛋白質的結合能力或其作為調控分子的作用。
• 改變 mRNA 的穩定性或翻譯效率： 編輯事件也可能影響 mRNA 的結構，進而影響其在細胞內的穩定性或翻譯起始的效率。

總結： RNA 編輯通過改變 RNA 序列，可以精細地調控基因表達的產物，產生具有不同功能或活性的蛋白質，或改變非編碼 RNA 的功能，從而增加基因組的資訊容量和生物體的複雜性。

第二部分：判斷正確敘述

需要逐一分析選項：

• A) The editosome can edit in 5' to 3' direction along the primary RNA transcript.

  • 分析： RNA 編輯的執行者是編輯體（editosome），它包含多種蛋白質，如 ADARs（Adenosine Deaminases Acting on RNA）或 APOBECs（Apolipoprotein B mRNA Editing Catalytic Polypeptide-like proteins）。這些酶的活性方向通常是沿著 RNA 鏈進行的。ADARs 酶通常通過識別雙鏈 RNA 結構來進行編輯，其作用可以跨越一段區域。APOBEC1 則通過催化 C-to-U 的脫氨反應。編輯過程的執行方向（5'->3' 或 3'->5'）取決於具體的編輯酶和底物 RNA 的結構。對於 ADARs 介導的 A-to-I 編輯，它通常發生在雙鏈 RNA 區域，編輯酶可以識別並作用於 RNA 的不同位置。然而，很多編輯酶（如 ADARs）的工作方式更像是沿著 RNA 鏈「掃描」並識別編輯位點。有些研究表明，ADARs 的編輯活性可能是 5' 到 3' 的方向性。但更精確地說，編輯體包含多個組分，其作用可能不是單純的線性掃描。
  • 判斷： 這個敘述是可能正確的，因為許多 RNA 編輯酶（如 ADARs）在識別雙鏈 RNA 結構後，其催化活性是沿著 RNA 鏈進行的，可以被認為是沿著轉錄本工作。

• B) Edited mRNAs could have the amino acid sequence of the encoded protein differs from that predicted by the genomic DNA sequence.

  • 分析： 這是 RNA 編輯最核心的影響之一。如果編輯發生在 mRNA 的編碼區，並且改變了一個密碼子，那麼翻譯出的蛋白質胺基酸序列就會與僅根據基因組 DNA 序列預測的序列不同。例如，人類 APOB 基因的 mRNA 編輯（C-to-U）在特定位點會產生一個終止密碼子，導致翻譯出較短的 APOBEC1 蛋白質。
  • 判斷： 這個敘述是正確的。