112 年 國立中央大學環境工程研究所甲組《環境化學及環境微生物學》

此題主要在考察學生對格蘭氏染色原理及其與細菌細胞壁結構的關聯性。

格蘭氏染色原理

格蘭氏染色法是微生物學中最常用的一種鑑別染色法，由丹麥細菌學家漢斯·克里斯蒂安·格蘭（Hans Christian Gram）於 1884 年發明。此法的關鍵在於利用結晶紫（crystal violet）染料和碘（iodine）作為媒染劑，再以酒精（alcohol）或酒精-丙酮（alcohol-acetone）作為脫色劑，最後用複紅（safranin）或其他對比染料進行複染。

細菌細胞壁的結構差異會影響其對脫色劑的抵抗能力，進而導致染色結果的不同。

格蘭氏陽性菌 (Gram-positive bacteria)

1. 細胞壁結構：

   • 主要由一層厚厚的肽聚醣（peptidoglycan）層組成，厚度可達 20-80 nm。
   • 肽聚醣層外通常有一層質酸（teichoic acid）和脂質質酸（lipoteichoic acid），這些分子有助於維持細胞壁結構並與細胞膜結合。
   • 外膜（outer membrane）缺失。

2. 格蘭氏染色過程中的行為：

   • 厚肽聚醣層能有效阻止脫色劑（酒精）進入細胞內部，或在酒精作用下使肽聚醣層收縮，關閉其孔隙，從而阻止結晶紫-碘複合物（CV-I complex）被脫去。
   • 因此，格蘭氏陽性菌在複染後會保持結晶紫的藍紫色。

3. 染色結果： 藍紫色。

格蘭氏陰性菌 (Gram-negative bacteria)

此題主要在考察學生對微生物好氧、厭氧及各級電子接受體利用順序的理解，以及如何應用此概念於污染場址的生物復育情境。

核心觀念：氧化還原梯度與電子接受體利用順序

在缺乏氧氣的厭氧環境中，微生物會依賴不同的電子接受體進行呼吸作用。這些電子接受體的氧化還原電位（redox potential）不同，通常微生物會優先利用氧化還原電位較高（即較容易接受電子，能量產率較高）的電子接受體。此順序大致如下：

1. 好氧呼吸 (Aerobic respiration): 以 $O_2$ 為最終電子接受體，產生 $H_2O$。這是能量產率最高的過程。
2. 硝酸鹽還原 (Nitrate reduction / Denitrification): 以 $NO_3^-$ 為最終電子接受體，產生 $N_2$。
3. 鐵(III)還原 (Fe(III) reduction): 以 $Fe^{3+}$ 為最終電子接受體，產生 $Fe^{2+}$。
4. 硫酸鹽還原 (Sulfate reduction): 以 $SO_4^{2-}$ 為最終電子接受體，產生 $H_2S$。
5. 甲烷生成 (Methanogenesis): 以 $CO_2$ 或其他有機物為電子接受體，產生 $CH_4$。這是能量產率最低的過程。

污染情境分析

污染物質包含：

• 甲苯 (Toluene): 有機污染物，可作為電子供體（被氧化）。
• 濃硫酸 ($H_2SO_4$): 提供 $SO_4^{2-}$，可作為電子接受體。
• 濃硝酸鐵 ($Fe(NO_3)_3$): 提供 $NO_3^-$ 和 $Fe^{3+}$，皆可作為電子接受體。

生物復育過程預測

當地下水層受到污染後，原生微生物群落會開始利用這些可用的電子供體和電子接受體。由於題目設定是在「食物充足」且「優勢菌群出現的先後順序」由電子接受體決定，我們可以推測以下過程：

1. 初期： 雖然地下水層可能已缺氧，但若有殘餘氧氣，好氧菌可能先作用。然而，由於是「惡意傾倒」的廢液，且時間推移，缺氧是常態。污染物質（甲苯）的存在提供了豐富的電子供體。
2. 電子接受體消耗順序：
   • $NO_3^-$ 和 $Fe^{3+}$： 污染廢液中同時含有硝酸鐵，提供了 $NO_3^-$ 和 $Fe^{3+}$。根據氧化還原梯度，微生物會優先利用 $NO_3^-$（硝酸鹽還原菌）和 $Fe^{3+}$（鐵(III)還原菌）。這兩種反應的發生時間可能會重疊，但若要區分，硝酸鹽還原的氧化還原電位通常比鐵(III)還原稍高，故硝酸鹽還原菌可能稍早發揮作用或比例更高。
   • $SO_4^{2-}$： 硫酸鹽還原菌會在其後的階段利用 $SO_4^{2-}$。
   • $CH_4$： 甲烷生成菌則在所有其他更優勢的電子接受體耗盡後，利用剩餘的有機物和 $CO_2$ 等進行作用。

觀測井濃度變化示意圖 (VS. Time)

我們可以根據上述的電子接受體利用順序，繪製觀測井中 $O_2$, $NO_3^-$, $SO_4^{2-}$, $Fe^{2+}$, $CH_4$ 的濃度隨時間變化的示意圖。

• $O_2$： 在厭氧環境中，氧氣會非常快速地被消耗，濃度會迅速下降至接近零。
• $NO_3^-$： 隨著硝酸鹽還原菌利用 $NO_3^-$ 作為電子接受體氧化有機污染物（甲苯），其濃度會逐漸下降。
• $SO_4^{2-}$： 在 $NO_3^-$ 和 $Fe^{3+}$ 被大量消耗後，硫酸鹽還原菌開始作用，消耗 $SO_4^{2-}$，其濃度也會下降。

此題主要考察學生對幾種重要厭氧代謝途徑的理解，包括其反應物、產物以及在生物地球化學循環中的作用。

核心觀念：厭氧代謝途徑

這些途徑都是在缺氧或無氧環境下進行的微生物代謝過程，涉及將有機物或無機物作為電子供體，並利用特定的無機物作為最終電子接受體，從而獲取能量。

(1) 脫硝作用 (Denitrification)

• 定義： 脫硝作用是指微生物將硝酸鹽 ($NO_3^-$) 或亞硝酸鹽 ($NO_2^-$) 等含氮氧化物，在缺氧條件下，還原為氣態氮化合物（主要是氮氣 $N_2$，也可能包括一氧化二氮 $N_2O$ 或一氧化氮 $NO$）的過程。
• 生物化學途徑： 這是一個多步驟的還原過程，通常以有機物或 $H_2$ 作為電子供體，$NO_3^-$ 作為最終電子接受體。
  $NO_3^- \xrightarrow{nitrate \: reductase} NO_2^- \xrightarrow{nitrite \: reductase} NO \xrightarrow{nitric \: oxide \: reductase} N_2O \xrightarrow{nitrous \: oxide \: reductase} N_2$
• 代謝物： 主要產物是氮氣 ($N_2$)。
• 在生物地球化學循環中的角色：
  • 將水體和土壤中的過量氮素轉化為氣態氮，從而從生物圈中移除氮，有助於防止水體富營養化。
  • 是氮循環中的重要環節，將氮從生物可利用形式轉化為不可利用的氣態形式，完成氮的「循環」。
  • 在厭氧環境中，也作為一種重要的異化作用，為微生物提供能量。

(2) 硫酸鹽還原作用 (Dissimilatory Sulfate Reduction)

• 定義： 硫酸鹽還原作用是指某些厭氧細菌和古菌利用硫酸鹽 ($SO_4^{2-}$) 作為最終電子接受體，將其還原為硫化氫 ($H_2S$) 的過程。此過程是「異化作用」（dissimilatory），意味著其主要目的是獲取能量，而不是將硫納入細胞作為合成成分（這稱為「同化作用」assimilatory sulfate reduction）。
• 生物化學途徑：
  1. 硫酸鹽首先被活化為磷酸腺苷-硫酸鹽 (APS) 和磷酸腺苷-磷酸硫酸鹽 (PAPS)。
  2. APS 被還原為亞硫酸鹽 ($SO_3^{2-}$)。
  3. 亞硫酸鹽進一步被還原為硫化物 ($S^{2-}$)，最終形成硫化氫 ($H_2S$)。
  • 電子供體通常是有機酸（如乙酸、乳酸）或氫氣 ($H_2$)。
• 代謝物： 主要產物是硫化氫 ($H_2S$)。
• 在生物地球化學循環中的角色：
  • 硫酸鹽還原菌是厭氧環境（如沉積物、沼澤）中的重要分解者。
  • 將有機物中的硫以 $H_2S$ 的形式釋放出來，為其他微生物（如產甲烷菌）提供電子供體。
  • $H_2S$ 是一種有毒氣體，也是一種還原劑，參與硫循環。
  • 在某些環境中，硫酸鹽還原也是甲烷生成的競爭性電子接受過程。

(3) 還原性乙酸生成作用 (Homoacetogenesis)

• 定義： 還原性乙酸生成作用是指某些厭氧微生物，利用氫氣 ($H_2$) 作為電子供體，二氧化碳 ($CO_2$) 作為電子接受體，將兩者結合生成乙酸 ($CH_3COOH$) 的過程。

此題旨在考察學生對環境微生物基本分類的理解，特別是根據能量來源和碳源進行的分類。

核心觀念：微生物能量與碳源分類

微生物的分類可以基於兩種主要來源：

1. 能量來源 (Energy Source):
   • 化學能 (Chemo-): 從化學反應中獲取能量。
   • 光能 (Photo-): 從光能中獲取能量。
2. 碳源 (Carbon Source):
   • 無機碳 (Litho-): 利用無機碳化合物（如 $CO_2$）作為碳源。
   • 有機碳 (Organo-): 利用有機碳化合物（如葡萄糖、乙酸）作為碳源。

(1) Chemo-lithotroph 與 Chemo-organotroph 之差異

這兩類微生物都利用化學能，但它們的碳源來源不同。

• Chemo-lithotroph (化學無機營養菌)：

  • 能量來源： 化學能（來自無機化合物的氧化）。
  • 碳源： 無機碳（主要是 $CO_2$）。
  • 定義： 這類微生物利用無機化合物（如 $H_2$, $H_2S$, $NH_3$, $Fe^{2+}$ 等）的氧化反應來獲取能量，並利用 $CO_2$ 作為唯一的碳源來合成自身的有機分子。
  • 例子： 硝化細菌（Nitrosomonas 將 $NH_3$ 氧化為 $NO_2^-$，Nitrobacter 將 $NO_2^-$ 氧化為 $NO_3^-$）、鐵細菌（如 Gallionella 氧化 $Fe^{2+}$）、硫細菌（如 Beggiatoa 氧化 $H_2S$）。
  • 在環境中的作用： 在生物地球化學循環中扮演重要角色，例如氮循環、硫循環、鐵循環。

• Chemo-organotroph (化學有機營養菌)：

  • 能量來源： 化學能（來自有機化合物的氧化或還原）。
  • 碳源： 有機碳（來自有機化合物）。
  • 定義： 這類微生物利用有機化合物的氧化（異營性呼吸）或發酵來獲取能量，同時也利用有機化合物作為碳源來合成自身的有機分子。
  • 例子： 大多數細菌、真菌、原生動物，包括許多環境中的分解者（如 Pseudomonas, Bacillus, 酵母菌）。
  • 在環境中的作用： 是環境中主要的分解者，將複雜的有機物分解為簡單的無機物，參與有機物的循環。

差異總結：

特徵	Chemo-lithotroph	Chemo-organotroph
能量來源	無機物氧化	有機物氧化/發酵
碳源	無機碳 ($CO_2$)	有機碳 (有機化合物)
範例	硝化細菌、鐵細菌、硫細菌	大多數細菌、真菌、原生動物
主要角色	生物地球化學循環中的能量轉換者	有機物分解者

(2) Autotroph 與 Heterotroph 之差異

這兩類微生物的差異在於它們利用碳源的方式。

• Autotroph (自營營養菌)：
  • 定義： 這類微生物能夠利用無機碳源（主要是 $CO_2$）合成自身所需的有機分子。