115 年 國立中央大學環境工程研究所甲組《環境化學及環境微生物學》

本題在探討原核生物分類學上的重要分子標記。16S rRNA 基因序列因其在原核生物中普遍存在、保守性與變異性適中，且易於定序分析，成為目前廣泛用來進行細菌與古菌分類、鑑定及建構演化關係的金標準。
(A) 5S rRNA 雖然也存在於原核生物，但變異性較大，較不適用於精確的分類。

本題考驗對氮肥種類及其在土壤中可能產生的微生物反應的理解，特別是與鎘污染和硫化物沉澱的關聯性。農友的策略是將鎘轉化為溶解度極低的硫化鎘（CdS），以降低其生物有效性。這個策略的關鍵在於產生足夠的硫化物（S^2-）。硫化物主要由硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria, SRB）在厭氧條件下，利用硫酸鹽（SO4^2-）作為最終電子接受者，將其還原為硫化物。然而，氮肥的種類會影響土壤的還原電位（redox potential）和微生物的代謝途徑，進而影響 SRB 的活性。

我們需要評估哪種氮肥最可能抑制硫化物生成，或導致不利於硫化物沉澱的環境。
(A) CO(NH2)2 是尿素，在土壤中會被脲酶（urease）分解為氨（NH3）和二氧化碳（CO2）。氨在水中會形成銨離子（NH4+）和氫氧根離子（OH-），提高 pH 值。pH 升高通常有利於硫化物（S^2-）的生成，因為 SRB 的活性在 pH 略高於中性時較佳，且硫化氫（H2S）在較高 pH 下更容易解離成 S^2-。
(B) NH4Cl 是氯化銨，水中主要以 NH4+ 形式存在。銨離子可以被硝化作用（nitrification）或脫硝作用（denitrification）的微生物利用，但它本身不會直接顯著影響土壤的還原電位或 pH。
(C) NH4NO3 是硝酸銨，在水中會解離成 NH4+ 和 NO3-。

本題考驗對不同消毒劑作用機制及其穿透細胞能力的理解，特別是考量到抗生素抗性基因（ARGs）可能存在於胞內，以及廢水處理流程中缺乏除氮除磷單元的影響。消毒劑是否能有效使胞內 ARGs 失活，取決於其穿透細胞膜的能力以及氧化/破壞 DNA 的效率。

核心觀念：

1. 胞內 ARGs 的問題：大部分 ARGs 位於細胞內，消毒劑需要穿透細胞膜才能作用於 DNA。
2. 消毒劑的穿透性與氧化性：不同消毒劑的細胞穿透能力和氧化能力不同。
3. 廢水處理單元影響：缺乏除氮除磷單元可能意味著廢水中含有較高的氨氮和有機物，這會影響某些消毒劑的效力。

逐一分析選項：
(A) 紫外光 (UV)：UV 消毒主要透過吸收 UV 輻射而直接破壞微生物的 DNA 和 RNA，使其無法複製。UV 的穿透力相對較差，尤其是在含有懸浮固體（SS）或色度較高的水中，UV 會被遮蔽，無法有效照射到胞內或被 SS 包覆的微生物。此外，UV 消毒主要是物理性的破壞，對於 DNA 的修復機制（如光復作用、暗修復）可能無法完全使其失活。當廢水中 SS 較高時，UV 消毒效果會顯著下降，胞內 ARGs 的失活效率也可能不高。

(B) 臭氧 (O3)：臭氧是一種強氧化劑，可以透過直接氧化和間接產生羥基自由基（•OH）來殺滅微生物。臭氧的氧化性非常強，可以有效穿透細胞膜，並氧化細胞內的 DNA、RNA、蛋白質等。因此，臭氧對於胞內 ARGs 的失活能力通常較強。

(C) 自由氯 (Cl2)：自由氯（如次氯酸 HClO 和次氯酸根離子 ClO-）也是一種強氧化劑。HClO 的穿透能力比 O3 稍弱，但仍能穿透細胞膜。然而，自由氯的殺菌效果會受到水中氨氮的顯著影響。在有氨氮存在的條件下，氯會與氨反應生成氯胺（chloramines），如一氯胺（NH2Cl）、二氯胺（NHCl2）和三氯化氮（NCl3）。氯胺的氧化性和殺菌能力遠低於自由氯，且穿透細胞膜的能力也較差。

核心觀念

本題考查微生物在對數生長期的比生長速率與世代時間。

純菌數量呈倍數增加時，可用下式表示：

其中：

• $N_0$：初始菌數
• $N$：經過時間 $t$ 後的菌數
• $\mu$：生長速率，單位為時間$^{-1}$
• $t$：培養時間

因此，生長速率為：

世代時間 $g$ 與生長速率的關係為：

解題方法

已知：

代入菌數變化公式：

先計算菌數倍率：

因此：

所以生長速率約為：

亦可利用世代時間快速驗算。2 小時共有：

個世代，因此理論菌數為：

與題目給出的 $1315$ 個/mL 非常接近，表示其生長速率應接近：

核心觀念

本題考查水體沉積物或深水環境中的「氧化還原分層」與電子受體利用順序。當環境幾乎沒有混合時，微生物會依序利用能量較高、還原電位較適合的電子受體：

其中：

• 氧氣還原後形成水。
• 硝酸鹽還原後形成氮氣或其他含氮還原產物。
• 錳氧化物還原後形成 $Mn^{2+}$。
• 鐵氧化物還原後形成 $Fe^{2+}$。
• 硫酸鹽還原後形成硫化氫 $H_2S$。

因此，圖中由淺至深的分層應依序呈現氧氣消耗、硝酸鹽還原、錳還原、鐵還原及硫酸鹽還原。

解題方法

由圖中深度方向判斷，最表層的區域優先使用氧氣，因此：

• I：$O_2$
• II：$NO_3^-$
• III：$Mn^{2+}$，代表錳氧化物被還原後的產物
• IV：$Fe^{2+}$，代表三價鐵被還原後的產物
• V：$H_2S$，代表硫酸鹽還原後的產物

所以排列為：

選項分析

本題考驗對原核生物（Prokaryote）與真核生物（Eukaryote）基本分類的認識。原核生物是結構最簡單、演化最古老的生物類型，其細胞沒有真正的細胞核，遺傳物質散佈在細胞質中。

原核生物主要包含兩大域（Domains）：

1. 細菌域 (Bacteria)：我們通常所說的「細菌」就屬於這個域。
2. 古菌域 (Archaea)：也稱為古細菌，雖然在形態上常與細菌相似，但在生化、分子結構和遺傳學上與細菌有顯著差異，被歸為獨立的域。

本題考驗對細菌水平基因轉移（Horizontal Gene Transfer, HGT）機制的理解。水平基因轉移是指細菌個體之間直接進行遺傳物質（DNA）的交換，這與垂直基因轉移（從親代傳遞給子代）不同，是細菌演化和適應的重要途徑，也是抗生素抗性基因傳播的重要原因。

水平基因轉移主要有三種機制：

1. 轉化 (Transformation)：細菌細胞直接吸收環境中游離的 DNA 片段，並將其整合到自己的基因組中。
2. 轉導 (Transduction)：由噬菌體（bacteriophage）介導的基因轉移。在噬菌體感染細菌的過程中，可能會將細菌的 DNA 片段錯誤地包裝到新的噬菌體顆粒中，然後通過感染其他細菌來傳遞這些 DNA 片段。

本題考驗對微生物能量來源和碳源來源分類的理解。微生物可以根據其能量來源和碳源來源進行分類。

1. 能量來源：

   • Phototroph (光能營素)：從光能獲取能量。
   • Chemotroph (化能營素)：從化學物質的氧化還原反應中獲取能量。

2. 碳源來源：

   • Autotroph (自營素)：利用無機碳（如 CO2）作為碳源。
   • Heterotroph (異營素)：利用有機碳作為碳源。

3. 電子供體來源：

   • Lithotroph (無機營素)：利用無機物（如 H2, H2S, NH3, Fe2+）作為電子供體。
   • Organotroph (有機營素)：利用有機物（如葡萄糖、氨基酸）作為電子供體。

題目中提到「硫酸鹽還原菌僅以氫氣(H2)作為電子供體」。

• 能量來源：硫酸鹽還原菌是通過氧化無機物（如 H2）來獲得能量，並將硫酸鹽（SO4^2-）作為最終電子接受者進行還原。因此，它們是 Chemotroph (化能營素)。
• 電子供體來源：題目明確指出電子供體是氫氣（H2），H2 是一種無機物。因此，該菌是 Lithotroph (無機營素)。

綜合以上兩點，該菌同時是 Chemotroph 和 Lithotroph。
題幹中問的是「該菌可被歸類為」，我們需要從選項中選擇最適合的分類。

選項分析：
(A) Phototroph：從光能獲取能量，不符。
(B) Lithotroph：利用無機物（H2）作為電子供體，符合。
(C) Autotroph：利用無機碳（CO2）作為碳源。題目未提供碳源資訊，但硫酸鹽還原菌通常是自營的，不過這不是題幹直接給出的資訊，且 Lithotroph 是關於電子供體的分類。
(D) Organotroph：利用有機物作為電子供體，不符，因為題目明確指出是 H2。
(E) Chemotroph：從化學物質氧化還原獲取能量，符合。

在 Chemotroph 中，又可以細分為 Lithotroph 和 Organotroph。題幹中明確指出了電子供體是無機物 H2，所以 Lithotroph 是更精確的描述。
同時，它也是 Chemotroph。題目通常會問最直接或最特定的分類。
如果題目問的是能量來源，那就是 Chemotroph。
如果題目問的是電子供體來源，那就是 Lithotroph。

本題考驗對厭氧消化（Anaerobic Digestion）過程及其產物——沼氣（Biogas）組成的了解。厭氧消化是微生物在無氧條件下分解有機物的過程，主要發生在還原性環境中，常見於廢水處理的污泥消化、垃圾掩埋場、濕地等。

沼氣的主要成分是甲烷（CH4）和二氧化碳（CO2）。這兩種氣體是由厭氧消化過程中的不同階段的微生物產生的：

1. 水解階段 (Hydrolysis)：複雜的有機物（如碳水化合物、蛋白質、脂類）被胞外酶分解為簡單的單體（如單醣、胺基酸、脂肪酸）。
2. 酸化階段 (Acidogenesis)：單體被厭氧菌轉化為揮發性脂肪酸（VFA，如乙酸、丙酸、丁酸）、醇類、氨、硫化氫（H2S）和二氧化碳（CO2）。
3. 產乙酸階段 (Acetogenesis)：揮發性脂肪酸和醇類被產乙酸菌轉化為乙酸（醋酸）、H2 和 CO2。
4. 產甲烷階段 (Methanogenesis)：
   • 產乙酸甲烷菌 (Acetoclastic methanogens)：利用乙酸產生甲烷和二氧化碳。

核心觀念

本題考查氮循環中不同菌群的主要代謝途徑，以及溫室氣體氧化亞氮 $N_2O$ 在其中的生成位置。

脫硝作用是將硝酸鹽逐步還原為氮氣的厭氧呼吸過程：

其中 $N_2O$ 是脫硝作用的重要中間產物。當脫硝反應不完全，或負責將 $N_2O$ 還原為 $N_2$ 的酵素活性不足時，$N_2O$ 便會累積並逸散至大氣中。

解題方法

判斷各選項的主要代謝終產物，找出具有「硝酸鹽還原並經由 $N_2O$ 生成氮氣」途徑的菌群。

標準脫硝途徑如下：

因此，脫硝菌在代謝過程中會生成 $N_2O$，且 $N_2O$ 是其反應鏈中的中間產物。

選項分析

(A) 硝化菌

硝化菌進行硝化作用，主要將氨氮氧化為亞硝酸鹽，再氧化為硝酸鹽：

在低溶氧、氧氣不足或亞硝酸鹽累積時，部分硝化菌可進行「硝化菌脫硝作用」，產生少量 $N_2O$。不過在基礎氮循環分類中，硝化作用的主要產物是 $NO_2^-$ 與 $NO_3^-$，$N_2O$ 並非其典型主要產物，因此不是本題單選題的標準答案。

(B) 脫硝菌

本題考驗對常見細菌革蘭氏染色反應的記憶。革蘭氏染色法是細菌學中一種重要的鑑別染色方法，根據細菌細胞壁的結構差異，將細菌分為革蘭氏陽性菌（Gram-positive）和革蘭氏陰性菌（Gram-negative）。

革蘭氏陽性菌的細胞壁主要由厚層肽聚醣（peptidoglycan）組成，在染色過程中能Retention 結晶紫-碘複合物，因此在脫色後仍呈現紫色。
革蘭氏陰性菌的細胞壁肽聚醣層較薄，且外層有脂多醣（lipopolysaccharide, LPS）層，在脫色步驟中，酒精會溶解脂多醣層並從薄肽聚醣層中滲出，導致結晶紫-碘複合物被洗脫，之後再染上復染劑（如番紅），呈現紅色或粉紅色。

我們需要逐一判斷選項中細菌的革蘭氏染色反應：
(A) Desulfovibrio desulfuricans：屬於 δ-變形菌綱（Delta-proteob

本題考驗對革蘭氏染色步驟及所用試劑的了解。革蘭氏染色法是一個多步驟的染色過程，需要特定的試劑來區分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。

標準的革蘭氏染色步驟和試劑包括：

1. 初染 (Primary stain)：使用 結晶紫 (Crystal violet)。所有細菌細胞都會被結晶紫染色成紫色。
2. 媒染劑 (Mordant)：使用 碘液 (Iodine solution)（通常是碘-碘化鉀溶液）。碘液與結晶紫形成不溶性的複合物，幫助結晶紫更牢固地附著在革蘭氏陽性菌的細胞壁上。
3. 脫色劑 (Decolorizing agent)：使用 乙醇 (Ethanol) 或酒精-丙酮混合物。這是革蘭氏染色法中最關鍵的一步，用於區分陽性菌和陰性菌。它會洗脫革蘭氏陰性菌細胞壁中的複合物，而革蘭氏陽性菌則能保留複合物。

核心觀念

三羧酸循環（Tricarboxylic Acid Cycle, TCA cycle）每回合分解 1 分子的 Acetyl-CoA，主要產生：

• 2 分子 $CO_2$
• 3 分子 $NADH$
• 1 分子 $FADH_2$
• 1 分子 $GTP$（部分教材以 ATP 表示）
• 1 分子 CoA-SH

其概略反應式為：

因此，本題是判斷各物質在循環中屬於反應物或產物。

解題方法

觀察 TCA 循環中的氧化還原反應與脫羧反應：

1. $NAD^+$ 接受電子與氫，被還原成 $NADH$。
2. $FAD$ 接受電子與氫，被還原成 $FADH_2$。
3. Acetyl-CoA 進入循環後，其碳骨架經氧化脫羧形成 $CO_2$。
4. Succinyl-CoA 轉換為 succinate 時，進行底物階層磷酸化，產生 GTP。

所以，$FADH_2$、GTP 與 $CO_2$ 均為 TCA 循環的產物。

選項分析

(A) FADH₂

正確。

在 succinate 經由 succinate dehydrogenase 氧化成 fumarate 時：

因此，$FAD$ 是反應物，$FADH_2$ 是產物。

(B) GTP

正確。

在 succinyl-CoA 轉換為 succinate 時，利用高能硫酯鍵所釋放的能量進行底物階層磷酸化：

本題考驗對活性污泥法中污泥膨化（Sludge Bulking）現象的成因及處理方法的了解。污泥膨化是指活性污泥絮體鬆散、體積膨脹，導致沉降性能嚴重下降，影響處理效果。其主要原因是某些絲狀細菌（如 Sphaerotilus natans, Thiothrix, Beggiatoa 等）過度增殖。

處理污泥膨化的策略，旨在抑制絲狀細菌的過度生長，促進絮凝菌的生長，或改善污泥的沉降性能。常見的處理方法包括：

1. 控制進水負荷：
   • 調整食微比 (Food-to-Microorganism ratio, F/M ratio)：這是關鍵。過低的 F/M 比（即過高的泥齡）有利於絲狀細菌的生長，因為它們在低營養負荷下競爭力較強。適當提高 F/M 比（縮短泥齡）可以抑制絲狀細菌。
   • 控制進水有機物濃度：過高的有機負荷可能導致缺氧，有利於某些絲狀細菌。
2. 改善溶解氧 (DO) 分佈：
   • 確保曝氣池內有足夠的溶解氧：雖然某些絲狀細菌在高負荷或缺氧條件下生長，但大多數活性污泥中的絲狀細菌需要氧氣。確保整個曝氣池有足夠的溶解氧，尤其是在進水端，可以抑制某些厭氧或兼性厭氧的絲狀細菌。
   • 控制曝氣強度和分佈：過度曝氣可能導致絮體破碎；曝氣不足則會造成局部缺氧，有利於特定絲狀細菌。
3. 化學藥劑處理：
   • 添加氯 (Chlorination)：在特定區域（如二沉池回流污泥或曝氣池進水段）短期、低劑量地添加氯，可以選擇性地殺滅絲狀細菌，但需注意劑量，以免影響正常絮凝菌。
   • 添加混凝劑/助凝劑 (Coagulants/Flocculants)：如聚氯化鋁 (PAC)、聚合硫酸鐵 (PFS)、聚丙烯醯胺 (PAM) 等。

本題考驗對糞便指標細菌（Fecal Indicator Bacteria, FIB）概念及其選擇標準的理解。糞便指標細菌的選擇標準旨在找到一種或幾種能夠可靠地指示糞便污染存在，並且其存在與腸道病原體同時存在，但又比病原體更容易檢測和數量更多，同時在環境中生存時間適中，以便追蹤污染源和評估污染程度的微生物。

選擇糞便指標細菌的理想條件包括：

1. 存在於腸道：必須是溫血動物（主要是人類和動物）腸道正常菌群的成員。
2. 與病原體同時存在：當腸道有病原體時，指標細菌也應該存在。
3. 數量豐富：在糞便中數量要遠大於病原體，以便於檢測。
4. 易於檢測：需要有簡單、快速、經濟的檢測方法。
5. 在環境中的行為相似：在環境（如水體）中的存活時間和分佈趨勢應與大多數腸道病原體相似，以便能指示病原體的潛在存在。但通常希望其比最頑強的病原體更容易滅活，以便在檢測到指標細菌時，病原體可能已經大大減少，反之，如果指標細菌還很多，則病原體可能也還存在。
6. 在環境中不能大量繁殖：如果指標細菌能在環境水中大量繁殖，則其數量的增加可能與糞便污染無關，從而影響判斷。

現在分析選項：
(A) 該菌應是溫血動物腸道菌群的成員：這是選擇糞便指標細菌的首要條件之一，因為這保證了其來源是糞便。例如，大腸桿菌（E. coli）和糞鏈球菌（Fecal streptococci）都是溫血動物腸道內的常見菌。
(B) 只要有腸道病原體的存在,就一定也會有該菌的存在：這也是一個重要的條件。指標細菌的數目能反映糞便污染的程度，並與病原體的存在相關。然而，「一定」這個詞比較絕對。實際上，並非所有糞便污染都含有所有類型的病原體，但指標細菌的存在強烈暗示了糞便污染，進而增加了病原體存在的可能性。這個條件是理想的，但實際應用中可能需要更嚴謹的表述。
(C) 該菌在環境中應比最強韌的腸道病原體具有更長的生存時間：這是錯誤的。理想情況下，指標細菌在環境中的存活時間應該與大多數病原體相似，或者比最頑強的病原體更容易滅活。如果指標細菌比病原體更長壽，那麼檢測到大量指標細菌時，病原體可能已經大大減少甚至消失，這會低估污染的風險。反之，如果指標細菌比病原體更容易滅活，當檢測到指標細菌時，病原體可能還存在。
(D) 該菌的菌數密度應與糞便污染程度有直接關係：這是非常重要的條件。指標細菌的數量應該能夠可靠地反映糞便污染的嚴重程度，這使得我們可以通過計數來評估水體被污染的程度。
(E) 該菌無法在自然環境水中生長：這是一個理想的條件，但實際上，某些指標細菌（如某些大腸桿菌菌株）在某些環境條件下可能發生有限的生長或存活時間延長。然而，關鍵在於它們不能在環境水中大量增殖到脫離糞便污染的水平。如果它們能在環境水中大量繁殖，那麼其數量的增加就不能直接反映糞便污染。