111 年 國立成功大學微生物及免疫學研究所乙組《分子生物學》

本題主要在探討染色體末端的結構「端粒 (Telomere)」及其相關酵素「端粒酶 (Telomerase)」在生物學及疾病中的作用。

【核心觀念】
端粒是位於真核生物線性染色體末端的特殊結構，由重複性的 DNA 序列和蛋白質組成，主要功能是保護染色體免於融合或染色體末端被當成 DNA 斷裂而被修復。端粒酶是一種反轉錄酶，負責合成端粒 DNA，以彌補細胞分裂過程中端粒的縮短。

【詳解】
(a) 端粒 (Telomere) 的定義與功能：
端粒是真核生物線性染色體末端的 DNA 重複序列（在人類中是 TTAGGG 的六核苷酸重複序列）與結合蛋白的複合體。其主要功能包括：

1. 染色體保護：防止染色體末端被染色體融合或被細胞的 DNA 修復機制誤認為斷裂點，進而引發不穩定的染色體重組。
2. 「末端複製問題」的緩解：由於 DNA 聚合酶的特性，線性 DNA 分子在複製時，其 5' 端無法被完全複製，導致每次細胞分裂後，端粒會稍微縮短。端粒的存在使得這種縮短發生在非基因區域，從而保護了重要的遺傳訊息。

(b) 端粒酶 (Telomerase) 的定義與功能：
端粒酶是一種特殊的 RNA 依賴性 DNA 聚合酶（reverse transcriptase），它攜帶一個 RNA 模板，並利用此模板合成端粒 DNA 的重複序列，將其加到染色體末端。

1. 維持端粒長度：在細胞分裂過程中，端粒酶能補充因複製而縮短的端粒，維持細胞的遺傳穩定性。

本題旨在釐清「表觀遺傳學的遺傳 (Epigenetics inheritance)」這一概念。

【核心觀念】
表觀遺傳學的遺傳是指在 DNA 序列不發生改變的情況下，通過遺傳給後代的表觀遺傳標記（如 DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼 RNA 等）來影響基因表現，進而產生可遺傳的性狀改變。

【詳解】
表觀遺傳學的遺傳（Epigenetic inheritance）是指基因表現的可遺傳變化，這些變化不涉及 DNA 本身的序列改變，而是通過在 DNA 或其相關蛋白質（如組蛋白）上引入可遺傳的化學修飾來實現。這些修飾可以影響染色質的結構，進而調控基因的開啟或關閉。

主要的表觀遺傳機制包括：

1. DNA 甲基化 (DNA Methylation)：在 DNA 的胞嘧啶鹼基上添加甲基基團，通常發生在 CpG 二核苷酸處。DNA 甲基化通常與基因沉默（基因表現被抑制）相關。
2. 組蛋白修飾 (Histone Modification)：組蛋白（如 H2A, H2B, H3, H4）是構成核小體的蛋白質。

本題要求設計實驗來驗證「蛋白質 A (Protein A)」是否為調控「基因 B (Gene B)」表現的「轉錄因子 (transcriptional factor)」。

【核心觀念】
轉錄因子是能夠結合到特定 DNA 序列（通常是基因啟動子或增強子區域）上，並調控基因轉錄起始的蛋白質。驗證其功能需要結合體內 (in vivo) 和體外 (in vitro) 的實驗方法。

【詳解】
要確定蛋白質 A 是否為調控基因 B 表現的轉錄因子，可以設計以下實驗：

實驗一：體內 (In vivo) 實驗

1. 基因表現分析 (Gene Expression Analysis)：
   • 觀察蛋白質 A 表現與基因 B 表現的相關性：
     • 比較在不同生理狀態或細胞類型中，蛋白質 A 的表現量（可通過 Western blot 或 ELISA 檢測）與基因 B 的 mRNA 或蛋白質表現量（可通過 RT-qPCR 或 Western blot 檢測）之間的相關性。如果蛋白質 A 表現升高時，基因 B 的表現也隨之升高（或降低），則存在相關性。
   • 基因敲除/敲低 (Gene Knockout/Knockdown) 或過表現 (Overexpression) 實驗：
     • 敲除/敲低蛋白質 A：使用 CRISPR/Cas9 技術或 shRNA/siRNA 等方法，在細胞中降低或去除蛋白質 A 的表現。觀察基因 B 的 mRNA 或蛋白質表現量是否顯著下降（如果是活化型轉錄因子）或上升（如果是抑制型轉錄因子）。
     • 過表現蛋白質 A：將編碼蛋白質 A 的基因導入細胞，使其過度表現。觀察基因 B 的表現量是否隨之改變。
   • 基因突變分析 (Mutation Analysis)：
     • 分析基因 B 的啟動子或調控區域，尋找可能與蛋白質 A 結合的 DNA 序列（啟動子或增強子元件）。
     • 利用基因工程技術，突變這些潛在的結合位點。觀察在突變後，蛋白質 A 是否還能有效調控基因 B 的表現。

實驗二：體外 (In vitro) 實驗

1. 蛋白質-DNA 結合實驗 (Protein-DNA Binding Assays)：
   • 電泳遷移率變動分析 (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)：

本題考查「轉譯 (Translation)」的機制，以及抗生素「小核菌素 (Puromycin)」如何抑制轉譯。

【核心觀念】
轉譯是將 mRNA 的遺傳密碼轉譯成蛋白質胺基酸序列的過程。這個過程主要在核糖體上進行，需要 mRNA、tRNA、胺基酸、酵素及能量參與。小核菌素是一種結構類似 tRNA 的抗生素，能干擾轉譯過程。

【詳解】
(a) 轉譯 (Translation) 的機制

轉譯是蛋白質合成的過程，主要發生在細胞質的核糖體上，可分為三個階段：起始 (Initiation)、延長 (Elongation) 和終止 (Termination)。

1. 起始 (Initiation)：

   • 核糖體組裝：小分子核糖體次單元 (30S in prokaryotes, 40S in eukaryotes) 結合到 mRNA 的起始密碼子（通常是 AUG）上。
   • 起始 tRNA 結合：攜帶第一個胺基酸（原核生物是甲硫胺酸，真核生物也是甲硫胺酸，但通常是修飾過的）的起始 tRNA，其反密碼子與起始密碼子配對。
   • 大分子次單元結合：大分子核糖體次單元 (50S in prokaryotes, 60S in eukaryotes) 結合，形成一個完整的起始複合物，包含 mRNA、起始 tRNA 和完整的核糖體。這個起始複合物具有三個 tRNA 結合位點：A 位 (aminoacyl site)、P 位 (peptidyl site) 和 E 位 (exit site)。起始 tRNA 位於 P 位。

2. 延長 (Elongation)：

   • 胺醯-tRNA 進入 A 位：一個攜帶特定胺基酸的胺醯-tRNA（aminoacyl-tRNA），其反密碼子與 mRNA 在 A 位上的下一個密碼子配對。此步驟需要能量（GTP）。
   • 肽鍵形成 (Peptide Bond Formation)：在核糖體大次單元的胜肽轉移酶 (peptidyl transferase) 活性下，P 位上的胜肽鏈（或第一個胺基酸）被轉移到 A 位上的胺醯-tRNA 的胺基酸上，形成新的肽鍵。此反應是催化性的，由核糖體 RNA（rRNA）催化，屬於核酶 (ribozyme) 活性。

本題要求設計實驗，以判斷一個在乳癌細胞中表現量增加的基因 X，是否與乳癌的腫瘤形成（致癌性，oncogenicity）有關。

【核心觀念】
致癌基因（oncogene）的特徵是其表現量異常升高，或其活性增強，導致細胞不受控制的增殖、存活，並可能促進腫瘤轉移。驗證一個基因是否為致癌基因，需要證明其表現增加能誘發腫瘤特性，以及抑制其表現能抑制腫瘤生長。

【詳解】
若發現基因 X 在乳癌細胞中的表現量增加，為了確定其是否與乳癌的腫瘤形成有關，可以設計以下一系列實驗：

步驟一：初步驗證基因 X 的表現與乳癌進展的關聯性

1. 多樣化樣本的表現量分析：
   • 檢測更多的乳癌細胞株和臨床樣本：使用 RT-qPCR、Western blot 或免疫組織化學 (IHC) 等方法，檢測基因 X 在不同種類的乳癌細胞株（如 ER+/PR+, HER2+, 三陰性乳癌）以及來自不同分期（早期、晚期）和不同預後（預後良好、預後差）的臨床乳癌組織樣本中的表現水平。
   • 與正常乳腺組織比較：將乳癌樣本中的基因 X 表現量與正常乳腺組織的表現量進行比較，以確定其表現增加的普遍性和顯著性。
   • 與其他腫瘤標記物關聯性分析：分析基因 X 的表現量是否與已知的乳癌腫瘤標記物（如 Ki-67、ER、PR、HER2 狀態）或臨床病理學特徵（如腫瘤大小、淋巴結轉移、分級）相關聯。

步驟二：體內 (In vivo) 實驗 - 證明基因 X 的致癌功能

1. 基因 X 過表現實驗 (Overexpression Study)：
   • 在正常乳腺細胞中導入基因 X：使用病毒載體（如慢病毒、腺病毒）或質體，將基因 X 的 cDNA 導入到非癌性的正常乳腺細胞株（如 MCF-10A）中，使其過度表現。
   • 評估細胞的增殖、遷移和侵襲能力：
     • 增殖實驗：通過 MTT assay, MTS assay, 或 cell counting 來測量細胞的生長速率。
     • 遷移實驗 (Migration Assay)：進行劃痕實驗 (scratch assay) 或 Transwell migration assay，評估細胞在體外遷移的能力。