113 年 國立成功大學微生物及免疫學研究所甲組《分子生物學》

此題考查分子生物學基礎名詞定義與概念。

(1)nonsense mutation
一種點突變，導致一個原本編碼特定胺基酸的密碼子（codon）被轉變為終止密碼子（stop codon, 如 UAA, UAG, UGA）。這會導致轉譯提前終止，產生一個截短的蛋白質，通常是無功能或功能異常的。
【答案】一種導致蛋白質轉譯提前終止的基因突變，因編碼特定胺基酸的密碼子被轉變為終止密碼子。

(2)epigenetics
研究在不改變 DNA 序列本身的情況下，影響基因表現的遺傳現象。這些表觀遺傳的改變是可遺傳的，並且可能受到環境因素的影響。常見的表觀遺傳機制包括 DNA 甲基化（DNA methylation）和組蛋白修飾（histone modification）。
【答案】研究在不改變 DNA 序列的情況下，通過調控基因表現的可遺傳機制，常見的有 DNA 甲基化和組蛋白修飾。

(3)Shine-Dalgarno sequence
一個位於原核生物 mRNA 上，在起始密碼子（AUG）上游約 6-12 個核苷酸處的核糖體結合位點（ribosome-binding site）。此序列富含嘌呤，其 3' 端與 16S 核糖體 RNA (rRNA) 的反序列互補，有助於核糖體準確地結合到 mRNA 上，並起始蛋白質的轉譯。

此題考查蛋白質結構的四個層次。

蛋白質結構是指蛋白質分子摺疊成特定三維空間構型的程度，通常分為四個層次：

1. 初級結構（Primary Structure）：指蛋白質分子中胺基酸的線性序列。這個序列由肽鍵（peptide bond）連接而成，決定了蛋白質的獨特性質。初級結構由基因編碼決定。
2. 次級結構（Secondary Structure）：指蛋白質多肽鏈局部區域的摺疊方式，主要是由於主鏈原子之間形成氫鍵所致。最常見的次級結構是 $\alpha$-螺旋（$\alpha$-helix）和 $\beta$-摺疊片（$\beta$-sheet）。

此題考查利用分子生物學方法設計實驗，探討基因 A 對基因 B 的調控作用，以及調控機制中涉及的蛋白質 A 的特定區域。

核心概念： 基因調控、轉錄因子、蛋白質結構域、基因表現分析、蛋白質工程。

(1) 探討基因 A 是否為基因 B 的轉錄因子

轉錄因子是能夠結合到 DNA 特定序列（如啟動子或增強子）並影響下游基因轉錄的蛋白質。要證明基因 A 編碼的蛋白質 A 是基因 B 的轉錄因子，可以設計以下實驗：

實驗設計：

• 步驟 1：確認蛋白質 A 的 DNA 結合能力。

  • 方法： 體外 DNA 結合實驗（In vitro DNA binding assays），如電泳遷移率變動分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）或 DNA 斷親和純化（DNA Affinity Purification）。
  • 操作：
    • EMSA： 將純化的蛋白質 A 與標記過的基因 B 的啟動子區域或潛在的增強子區域 DNA 片段混合。如果蛋白質 A 能結合到該 DNA 片段，則在電泳時，結合的複合物會比單獨的 DNA 片段移動得更慢，形成「遷移帶」的位移。需要設計對照組，例如使用非特異性 DNA 或不含蛋白質 A 的情況。
    • DNA 斷親和純化： 將基因 B 的啟動子或增強子區域 DNA 片段固定在固體載體上，然後將細胞裂解液（包含蛋白質 A）通過該載體。如果蛋白質 A 結合到 DNA 上，它會被純化下來，再通過質譜法（Mass Spectrometry）或 Western Blot 檢測是否存在蛋白質 A。
  • 預期結果： 如果蛋白質 A 能特異性地結合到基因 B 的調控區域，則支持其作為轉錄因子的可能性。

• 步驟 2：確認蛋白質 A 對基因 B 轉錄的影響。

  • 方法： 基因表現分析，如定量 PCR（Quantitative PCR, qPCR）、西方墨點法（Western Blot）檢測基因 B 的 mRNA 或蛋白質水準，或螢光報告基因分析（Reporter Gene Assay）。
  • 操作：
    • 細胞實驗： 在細胞培養中，可以過度表現（overexpression）或敲低（knockdown/knockout）基因 A，然後檢測基因 B 的 mRNA 或蛋白質表現水準。
    • 報導基因分析： 將基因 B 的啟動子區域連接到一個報告基因（如螢光素酶 luciferase 或綠色螢光蛋白 GFP）上，構建質體。將此質體轉染到細胞中，然後共轉染（co-transfect）表達蛋白質 A 的質體。檢測報告基因的活性。
  • 預期結果： 如果過度表現基因 A 導致基因 B 的表現增強（激活因子）或降低（抑制因子），並且在報告基因分析中觀察到類似的結果，則強烈支持蛋白質 A 是基因 B 的轉錄因子。

• 步驟 3：確認基因 B 的調控序列對蛋白質 A 結合的依賴性。

  • 方法： 突變啟動子/增強子區域，並重新進行上述結合和表達實驗。
  • 操作： 根據步驟 1 確定的結合位點，對基因 B 的調控區域進行點突變，破壞蛋白質 A 的結合位點。然後重新進行 EMSA 和報告基因分析。
  • 預期結果： 如果突變破壞了蛋白質 A 的結合能力，同時也消除了蛋白質 A 對基因 B 表現的調控作用，則進一步證明了蛋白質 A 是通過結合該 DNA 序列來調控基因 B 的。

總結： 結合以上實驗結果，如果蛋白質 A 能特異性結合基因 B 的調控區域，並且影響基因 B 的轉錄，則可證明基因 A 是基因 B 的轉錄因子。

(2) 確定蛋白質 A 中負責調控的胺基酸區域/結構域

一旦確定蛋白質 A 是轉錄因子，下一步是找出其結構中負責與 DNA 結合、或與其他轉錄複合物組分相互作用、或催化轉錄調控的關鍵區域。

實驗設計：

• 步驟 1：結構域預測與文獻查詢。
  • 方法： 利用生物資訊學工具（如 Pfam, SMART, NCBI CDD）預測蛋白質 A

此題考查研究蛋白質間相互作用的兩種技術及其工作原理。

研究蛋白質間的相互作用（Protein-Protein Interactions, PPIs）在理解細胞功能、信號傳導通路和疾病機制中至關重要。以下介紹兩種常用的技術：

技術一：酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）

• 原理 (4%)：
  Y2H 是一種體內（in vivo）篩選蛋白質間相互作用的遺傳學方法。它基於一種轉錄因子（如 GAL4）的結構特點：它包含一個 DNA 結合域（DNA-Binding Domain, DBD）和一個轉錄激活域（Activation Domain, AD），這兩個域在空間上是分離的，但結合在一起才能激活下游報告基因的轉錄。
  在 Y2H 實驗中，將一個蛋白質（稱為「誘餌」蛋白質，Bait）與 DBD 融合，將另一個蛋白質（稱為「獵物」蛋白質，Prey）與 AD 融合。如果 Bait 和 Prey 蛋白質之間存在相互作用，它們就會將 DBD 和 AD 帶到同一個空間位置，從而重新組合成一個有功能的轉錄因子，激活報告基因（如 HIS3, ADE2, lacZ）的表達。通過檢測報告基因的表達，可以判斷 Bait 和 Prey 蛋白質之間是否存在相互作用。

• 工作細節 (8%)：

  1. 載體構建： 構建兩個表達載體。一個載體包含 Bait 蛋白質的 cDNA，並與 GAL4 的 DNA 結合域（GAL4-DBD）融合。另一個載體包含 Prey 蛋白質的 cDNA，並與 GAL4 的激活域（GAL4-AD）融合。
  2. 酵母轉染： 將這兩個載體分別轉染到一個對報告基因呈陰性的酵母菌株中。
  3. 篩選： 將轉染了 Bait-DBD 和 Prey-AD 載體的酵母細胞在選擇性培養基（例如，缺乏組胺酸 HIS3 和缺乏腺嘌呤 ADE2 的培養基）上培養。只有當 Bait 和 Prey 相互作用，激活 HIS3 和 ADE2 基因的表達，酵母才能在這些培養基上生長。
  4. 結果驗證： 對在選擇性培養基上生長的酵母菌落進行進一步檢測，例如進行 $\beta$-半乳糖苷酶（$\beta$-galactosidase, lacZ）活性測試，以確認報告基因的激活，並排除假陽性結果（如報告基因發生了自身突變）。也可以通過 PCR 或測序驗證 Bait 和 Prey 的 cDNA。
  5. 優點： 能夠篩選大量的潛在相互作用，是一種高通量的方法。
  6. 缺點： 蛋白質可能在酵母細胞內的摺疊或修飾與在哺乳動物細胞中不同，可能產生假陽性和假陰性結果。Bait 和 Prey 必須能夠進入酵母細胞核。

技術二：免疫沉澱（Immunoprecipitation, IP）結合西方墨點法（Western Blot, WB）

• 原理 (4%)：
  免疫沉澱是一種體外（in vitro）或體內（in vivo）技術，利用抗體與目標蛋白質特異性結合的原理，將細胞裂解液中的目標

此題考查 CRISPR/Cas9 系統的工作機制及其應用。

CRISPR/Cas9 系統的工作機制 (15%)

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9 系統最初是一種細菌的適應性免疫系統，用於抵抗病毒感染。在基因工程中，它被改造為一種強大的基因編輯工具。該系統主要由兩個關鍵組分組成：

1. Cas9 核酸酶（Cas9 Nuclease）：這是一種 DNA 內切酶，能夠切割雙鏈 DNA。它具有兩個核酸酶結構域（RuvC 和 HNH），分別切割 DNA 的兩條鏈。Cas9 本身無法識別特定的 DNA 目標序列。
2. 導向 RNA（guide RNA, gRNA）：這是人為設計的 RNA 分子，用於引導 Cas9 到特定的 DNA 目標位點。gRNA 由兩部分組成：
   • CRISPR RNA (crRNA)：約 20 個核苷酸的序列，與目標 DNA 序列互補，負責識別和結合目標 DNA。
   • 反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA)：一個支架 RNA，與 crRNA 的 3' 端結合，並與 Cas9 蛋白結合，形成一個功能性的 CRISPR/Cas9 複合物。
     在基因編輯應用中，通常將 crRNA 和 tracrRNA 設計成一個單一的嵌合分子，稱為單導向 RNA（single-guide RNA, sgRNA）。

工作流程：

1. 複合物形成： sgRNA 與 Cas9 蛋白結合，形成一個功能性的 CRISPR/Cas9 複合物。
2. 目標識別： sgRNA 中的 crRNA 部分通過鹼基配對原則，識別並結合到目標 DNA 序列上。這個目標序列通常位於一個稱為 PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列的附近。PAM 序列是 Cas9 酶切割 DNA 所必需的，對於常見的 Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9），PAM 序列通常是 5'-NGG-3'（N 代表任意核苷酸）。Cas9 酶會檢查目標 DNA 序列的 PAM，如果存在，則會啟動 DNA 的結合和切割。
3. DNA 切割： 一旦 Cas9 酶通過 sgRNA 準確定位到目標 DNA 序列（緊鄰 PAM 序列），並且確認存在 PAM 序列後，Cas9 的 RuvC 和 HNH 結構域會分別切割 DNA 的兩條鏈，產生雙鏈斷裂（Double-Strand Break, DSB）。這個斷裂通常發生在 PAM 序列上游約 3 個鹼基對處。
4. DNA 修復： 細胞會利用自身的 DNA 修復機制來修復這個雙鏈斷裂。主要有兩種修復途徑：
   • 非同源末端連接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）：這是一種容易出錯的修復途徑，經常在斷裂處引入小的插入或缺失（indel），導致移碼突變，從而使目標基因失活（基因敲除，gene knockout）。