113 年 國立成功大學生物化學暨分子生物學研究所《分子生物學》

此題考查轉譯（translation）的分子機器。轉譯是將 mRNA 的序列轉譯成蛋白質的過程，這個過程由核糖體（Ribosome）負責執行。

此題考查轉譯過程中，負責將 mRNA 密碼子解碼成胺基酸序列的分子。在轉譯過程中，轉移 RNA（Transfer RNA, tRNA）扮演著關鍵角色。

此題考查基因轉錄後修飾（post-transcriptional modification）中的剪接（splicing）過程。

此題考查調控基因轉錄的 DNA 序列。啟動子（Promoter）是結合 RNA 聚合酶以啟動轉錄的區域，通常位於基因的起始點附近。

此題考查維持染色體長度的酶。染色體在每次細胞分裂時，由於 DNA 複製的「終端複製問題」（end replication problem），其末端會逐漸縮短。

此題考查前驅 mRNA 轉變成成熟 mRNA 的過程。真核生物基因轉錄產生的 pre-mRNA 包含內含子（introns）和外顯子（exons）。

此題考查逆轉錄（Reverse Transcription）的定義。逆轉錄是一個由 RNA 作為模板合成 DNA 的過程，與正常的 DNA 轉錄成 RNA 方向相反。

此題考查基因的結構與 mRNA 的形成。基因的編碼區域（coding region）中，有一些序列在轉錄後會被移除，這些被移除的序列稱為內含子（introns）。

此題考查基因調控中的蛋白質。啟動子（Promoter）是 DNA 序列，轉錄因子（Transcription Factor）是結合 DNA 的蛋白質，增強子（Enhancer）是 DNA 序列。

此題考查調控基因表現的小分子 RNA。微小 RNA（microRNA, miRNA）和小干擾 RNA（small interfering RNA, siRNA）都是一類內源性的、長度約 21-2

此題考查用於鑑定 DNA 結合蛋白結合位點的技術。DNA 足跡法（DNA Footprinting）是一種實驗技術，用於識別蛋白質與 DNA 結合的精確位置。

此題考查細胞或組織中所有轉錄產物的總稱。轉錄體（Transcriptome）是指在特定時間、特定細胞或組織中，所有活躍基因所產生的 RNA 分子（包括 mR

此題考查 RNA 合成 DNA 的過程。正常的轉錄（transcription）是 DNA 模板合成 RNA。而逆轉錄（Reverse Transcription）則是利用 RNA 作為模板合成 DNA。

此題考查具有催化活性的 RNA 分子。過去認為只有蛋白質能擔任酵素，但後來發現某些 RNA 分子也具有催化活性，被稱為核

此題考查基因表現過程中傳遞遺傳訊息的分子。DNA 儲存了遺傳訊息，但它位於細胞核內，而蛋白質合成（轉譯）發生在細胞質的核糖體上。

此題考查啟動基因轉錄的 DNA 區域。啟動子（Promoter）是位於基因上游（轉錄起始點之前）的一段 DNA 序列，它對 RNA 聚合酶

此題考查調控基因轉錄的蛋白質。轉錄因子（Transcription Factor）是一類能夠識別並結合到 DNA 特異序列（如啟動子、增強子、沉默子等）的蛋白質。

此題考查關於生命起源和早期演化的假說。RNA 世界假說（RNA world hypothesis）提出，在生命演化的早期階段，RNA 不僅扮演了遺傳物質的角色（類似現在的 DNA），同時也具有催化生物化學反應的能

此題考查用於基因沉默和 RNA 干擾的 RNA 結構。小干擾 RNA（small interfering RNA, siRNA）是由雙鏈 RNA（dsRNA）經過 Dicer 酶切割而來，長度約 21-25 個核苷酸的雙鏈 RNA 分子。當 siRNA 進入細胞後，它會與 RISC 複合體結合，然後利用其一條鏈作為導向，尋找並切割與之序列互補的 mRNA，從而達到基因沉默（gene silencing）或 RNA 干擾（RNA interference, RNAi）的目的。微小 RNA（miRNA）也有類似功能，但通常是內源性的，且機制略有不同。題目描述「由單股 RNA 分子形成」可能有些誤導，但 siRNA 的作用機制中，其一條鏈會引導 RISC 複合體，且 siRNA 本身是雙鏈 RNA 的產物，但其功能是干擾。然而，題目要求的是「結構」，且 siRNA 的功能與基因沉默、RNAi 緊密相關。

核心觀念

RNA 與蛋白質結合形成的複合體稱為 核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）。RNP 廣泛參與細胞內各種重要生物 प्रक्र程，包括：

• 核糖體（ribosome）：由 rRNA 與核糖體蛋白組成，負責蛋白質轉譯。
• 剪接體（spliceosome）：由 snRNA 與多種蛋白質組成，負責真核生物前驅 mRNA 的 RNA 剪接。
• 端粒酶（telomerase）：含有 RNA 模板與蛋白質成分，參與端粒延長。
• SRP（signal recognition particle）：由 RNA 與蛋白質組成，協助新生蛋白質定位至內質網。

因此，題幹以「由 RNA 和 protein 組成，並參與轉譯與 RNA splicing 等多種生物過程」描述的總稱，就是 RNP。

解題方法

題目屬於定義辨識題，可從題幹的兩個關鍵線索判斷：

1. 組成成分是 RNA 與 protein。
2. 功能涵蓋 translation 與 RNA splicing。

符合此定義的名詞為：

核糖體與剪接體雖然都是 RNP 的具體例子，但題目詢問的是能涵蓋這些複合體的通稱，因此答案不是單一的核糖體或剪接體。

此題考查基因調控元件（啟動子 vs. 增強子）的區分。啟動子（promoter）是啟動轉錄的基本區域，通常緊鄰基因的起始位點。增強子（enhancer）則可以遠距離增強轉錄效率。

核心觀念：啟動子是啟動轉錄的必要元件，而增強子是增強轉錄的元件。兩者的區別在於其對轉錄的「必要性」和「距離依賴性」。

a. 實驗設計：
為了區分一個序列是啟動子還是增強子，我們可以利用報告基因（reporter gene）系統。報告基因（例如螢光蛋白 GFP 或酶 LacZ）的表達水平可以反映其上游調控序列的活性。

實驗步驟：

1. 構築質體 (Plasmid construction):

   • 質體 A (對照組 - 包含已知啟動子): 將一個已知的、能有效啟動轉錄的啟動子（例如 CMV 啟動子）連接到報告基因的上游。
   • 質體 B (待測序列作為啟動子): 將待測的 upstream 序列連接到報告基因的上游。
   • 質體 C (待測序列作為增強子): 將待測的 upstream 序列插入到報告基因的下游（或遠端上游），並同時包含一個已知啟動子。
   • 質體 D (僅報告基因，陰性對照): 只包含報告基因，沒有任何啟動子或增強子。

2. 細胞轉染 (Cell transfection): 將上述構建的質體分別轉染到合適的細胞系中（例如哺乳動物細胞）。

3. 報告基因活性檢測 (Reporter gene assay): 在細胞培養一段時間後，測定報告基因的表達水平。

   • 如果是螢光蛋白，則測量細胞的螢光強度。

好的，我是您在台灣生命科學與農學研究所的分子生物學補教名師。針對國立成功大學生物化學暨分子生物學研究所 113 年的考題，我們來詳細解析第 22 題。

這題考的核心觀念是關於兩種重要的非編碼 RNA 分子：microRNA (miRNA) 和小干擾 RNA (siRNA)。這兩種 RNA 在細胞中扮演著關鍵的基因調控角色，主要透過與目標 mRNA 結合，進而影響蛋白質的表現。題目要求我們詳細比較並描述它們的異同。

第 22 題：請詳細比較並描述 microRNAs 和 small interfering RNAs (5 分)。

解題思路：

這題屬於比較題，要求我們深入探討 miRNA 和 siRNA 的結構、生成途徑、作用機制以及它們在基因調控中的功能。要獲得滿分，我們需要清晰地闡述它們的相似之處與差異之處，並提供足夠的細節來支持我們的論述。

詳細解題過程：

microRNAs (miRNAs) 和 small interfering RNAs (siRNAs) 都是長度約 21-25 個核苷酸的短非編碼 RNA (short non-coding RNAs)，它們在細胞中主要透過 RNA 干擾 (RNA interference, RNAi) 的機制來調控基因表現。儘管它們在功能上有相似之處，但它們的來源、生成途徑以及在調控上的精確性有所不同。

(a) 結構與大小：

• 相似之處： miRNA 和 siRNA 都是雙股 RNA 分子，長度約為 21-25 個核苷酸。在成熟的過程中，它們都會被加工成單股 RNA，並與蛋白質複合體結合發揮作用。
• 差異之處： 在形成成熟的單股 RNA 後，miRNA 通常會與 Argonaute (Ago) 蛋白結合，形成 RNA 誘導的沉默複合體 (RNA-induced silencing complex, RISC)。siRNA 也是與 Ago 蛋白結合，但其結合的特異性通常更高。

(b) 來源與生成途徑：

• miRNAs：

  • 來源： miRNA 的基因位於基因組中，可以位於基因的內含子 (intron) 或外顯子 (exon) 區域，也可以位於基因的間隔區。miRNA 的轉錄產物是稱為 pri-miRNA 的長鏈前驅物，具有髮夾結構 (hairpin structure)。
  • 生成途徑：
    1. 轉錄 (Transcription)： 在細胞核內，miRNA 基因由 RNA 聚合酶 II (RNA polymerase II) 轉錄成 pri-miRNA。
    2. 初步加工 (Primary Processing)： pri-miRNA 在細胞核內由 Drosha-DGCR8 複合物加工，切除髮夾結構上方的 RNA，形成約 70 個核苷酸的 pre-miRNA。
    3. 輸出 (Export)： pre-miRNA 被輸出到細胞質。
    4. 進一步加工 (Further Processing)： 在細胞質中，Dicer 酶會進一步切割 pre-miRNA 的髮夾結構，產生約 21-25 個核苷酸的雙股 miRNA 前驅物。
    5. RISC 組裝 (RISC Assembly)： 其中一股 miRNA (成熟鏈) 會與 Argonaute 蛋白結合，形成 RISC 複合體，另一股 (星鏈, star strand) 通常會被降解。

• siRNAs：

  • 來源： siRNA 通常來源於外源性的雙股 RNA (dsRNA)，例如病毒 RNA 或實驗室引入的 dsRNA。它們也可以來自於基因組中的重複序列或反轉錄轉座子 (transposable elements) 的轉錄產物。
  • 生成途徑：
    1. 外源 dsRNA (Exogenous dsRNA)： 外源性的雙股 RNA 分子在細胞質中直接被 Dicer 酶切割，產生約 21-25 個核苷酸的雙股 siRNA 前驅物。
    2. 內源 dsRNA (Endogenous dsRNA)： 如果是內源性的 dsRNA，其生成途徑可能較為複雜，但最終也會被 Dicer 酶切割。
    3. RISC 組裝 (RISC Assembly)： 與 miRNA 類似，其中一股 siRNA 會與 Argonaute 蛋白結合，形成 RISC 複合體。

(c) 作用機制與調控對象：

• miRNAs：
  • 作用機制： 成熟的 miRNA-RISC 複合體會透過其單股 miRNA 與目標 mRNA 的 3' 非轉譯區 (3' untranslated region, 3' UTR) 進行序列互補配對。這種配對通常是不完全互補 (imperfect complementarity)。
  • 調控結果： 不完全互補的配對會導致：
    • 轉譯抑制 (Translational repression)： 阻礙核醣體與 mRNA 的結合或移動，從而減少蛋白質的合成。

核心觀念

DNA 雙股斷裂（double-strand break, DSB）是 DNA 雙股在相近位置同時斷裂，會使染色體失去連續性；若未正確修復，可能造成大片段缺失、染色體易位或細胞死亡。細胞主要依是否使用同源 DNA 作為修復模板，採用同源重組修復、非同源末端接合，或其他末端接合途徑。

解題方法

a 題列出 DSB 修復機制，並比較是否使用模板、偏好的細胞週期及修復準確度。b 題則選擇能直接標記 DNA 斷裂末端、並以定序定位斷裂位置的方法。以下以 END-seq 作為主要實驗設計。

a. 雙股斷裂的修復機制

1. 同源重組修復（homologous recombination, HR）
   HR 利用未受損的同源 DNA 作為模板，通常以同一染色體上的姊妹染色單體為模板，因此主要發生於 S 期及 G2 期，修復準確度高。

   修復起始時，MRN 複合體（MRE11–RAD50–NBS1）與 CtIP 辨識斷裂端並促進 DNA 末端切除，產生 3′ 單股 DNA。RPA 先結合單股 DNA，之後 RAD51 取代 RPA，形成核蛋白絲並搜尋同源序列。RAD51 促使單股 DNA 入侵同源模板，形成 D-loop；接著以完整股為模板進行 DNA 合成，再經分枝遷移與結構解析，恢復 DNA 連續性。

2. 非同源末端接合（non-homologous end joining, NHEJ）
   NHEJ 不需要同源模板，細胞週期各階段都可進行。Ku70/Ku80 先結合斷裂末端並招募 DNA-PKcs；若 DNA 末端不相容，Artemis 等核酸酶會修整末端，DNA 聚合酶也可補入少量核苷酸。最後由 XRCC4–DNA ligase IV 複合體及 XLF 等因子將兩端接合。

   NHEJ 速度快，適用範圍廣，但末端修整可能造成小型插入或缺失，因此可能產生突變。

3. 替代性末端接合與微同源媒介末端接合（alternative end joining／microhomology-mediated end joining, alt-EJ/MMEJ）
   當典型 NHEJ 無法有效進行時，DNA 末端切除會露出斷裂兩端附近的短微同源序列，使兩端互相配對；之後移除不配對的 DNA，並由 DNA polymerase theta（Pol θ）等因子完成填補與接合。此途徑常造成缺失，也可能促成染色體易位。

核心觀念

DNA 聚合酶只能沿新生鏈的 $5' \to 3'$ 方向加上核苷酸，並以模板鏈的 $3' \to 5'$ 方向作為讀取方向。複製叉上的複製體（replisome）由解旋、引子合成、DNA 合成、引子移除及片段連接等蛋白質組成，協同完成前導股與延遲股的複製。

DNA 複製的高保真度來自數道防錯機制：DNA 聚合酶選擇正確核苷酸、聚合酶校對，以及複製後錯配修復。每一道機制都能降低錯誤率；合併作用後，複製錯誤率可降至每個鹼基對每次細胞世代約 $10^{-9}$ 至 $10^{-10}$ 的量級。

解題方法

本題分成兩部分作答：第一部分依照複製叉上 DNA 合成的先後順序，說明複製體的工作方式與真核細胞各股的主要聚合酶；第二部分依照「合成時辨識、合成後校對、複製後修復」整理保真機制，再提出可比較野生型與修復缺陷細胞的實驗。

（a）複製體如何合成 DNA 鏈

複製叉前進時，兩條親代 DNA 鏈被解開，但 DNA 聚合酶仍只能合成 $5' \to 3'$ 的新生鏈。因此，兩股的合成方式不同：

• 前導股：模板方向配合複製叉前進方向，DNA 以連續方式合成。
• 延遲股：模板方向與複製叉前進方向相反，只能以不連續方式合成多段岡崎片段（Okazaki fragments）。每段均從新引子開始，合成方向仍是 $5' \to 3'$。

真核複製叉的解旋酶為 CMG 複合體，由 Cdc45、MCM2–7 與 GINS 組成。解開的單股 DNA 由複製蛋白 A（RPA）結合並穩定，避免重新配對或形成二級結構。

真核細胞的主要合成步驟如下：

1. 合成引子：DNA 聚合酶 α–引子酶複合體先由引子酶合成短 RNA 引子，再由 DNA 聚合酶 α 延伸一小段 DNA。DNA 聚合酶 α 缺乏有效的 $3' \to 5'$ 校對活性，因此只負責起始，不負責長距離複製。
2. 切換至延伸聚合酶：RFC（複製因子 C）將 PCNA（增殖細胞核抗原）滑動夾載到引子–模板接合處。PCNA 提高 DNA 聚合酶與模板的結合能力，使長鏈合成更有效率。
3. 延伸兩股 DNA：DNA 聚合酶 ε 主要合成前導股；DNA 聚合酶 δ 主要合成延遲股。兩種聚合酶皆以 $5' \to 3'$ 方向延伸新生 DNA。
4. 成熟岡崎片段：DNA 聚合酶 δ 延伸後方岡崎片段時，可將前一片段的 RNA–DNA 引子置換成突出端；FEN1 切除短突出端，較長突出端可由 DNA2 協助處理。DNA 連接酶 I 最後封合 DNA 骨架上的缺口。

延遲股常以迴圈模型描述：延遲股模板形成迴圈，使前導股與延遲股的合成複合體能隨複製叉一起前進。每次延遲股完成一段岡崎片段後，舊迴圈解除，再形成新的迴圈並開始下一段合成。此模型解釋了兩股方向相反，卻能在同一複製叉附近協同合成。

（b）維持高保真度的機制與實驗例子

細胞以多層機制降低複製錯誤：

核心觀念

本題考查大腸桿菌染色體複製的起始複合體如何在雙股 DNA 上建立兩個複製叉。關鍵順序是：起始蛋白辨認複製起點、局部解開雙股 DNA、裝載解旋酶，再招募引子酶及 DNA 聚合酶，形成可雙向延伸的複製機器。

大腸桿菌的複製起點 oriC 含有多個 DnaA 結合區，以及富含 AT 鹼基的 DNA 解開區。AT 鹼基配對較易被打開，有利於起始時形成局部單股 DNA。

解題方法：依序追蹤起始複合體的組裝

1. DnaA 辨認 oriC 並形成起始蛋白複合體

具 ATP 結合狀態的 DnaA 先與 oriC 上的高親和力 DnaA 結合區結合，接著招募更多 DnaA，組成較大的蛋白複合體。DnaA 寡聚化使 oriC DNA 彎曲並受到包覆，將局部扭轉與張力集中於富含 AT 的解開區。

2. 打開 DNA 解開區，形成初始複製泡

隨著 DnaA 複合體穩定形成，oriC 的 AT-rich 解開區局部熔解，雙股 DNA 分開，產生含單股 DNA 的初始複製泡。這一步建立了後續解旋酶裝載所需的單股模板。

3. DnaC 將 DnaB 解旋酶裝載至 DNA

DnaC 是解旋酶裝載蛋白，與 DnaB 解旋酶形成複合體，並協助將 DnaB 裝載至已打開的 oriC。兩個 DnaB 六聚環分別在兩側的單股 DNA 上建立解旋位置。裝載完成後，DnaC 釋出，DnaB 得以啟動。

4. DnaB 擴大複製泡，建立雙向複製叉

核心觀念

哺乳類細胞的蛋白質周轉主要由兩套系統負責：

1. 泛素－蛋白酶體系統：以泛素標記特定蛋白質，再由蛋白酶體辨識並分解。
2. 溶酶體系統：將蛋白質送入含有酸性水解酶的溶酶體中分解；自噬是細胞內蛋白質與胞器進入溶酶體的重要途徑。

兩者共同維持蛋白質品質與細胞內穩態，但辨識方式、運送途徑及常見受質各有不同。

解題方法

作答時，分別交代每套系統的辨識或標記方式、運送過程、分解場所與常見受質，即可完整說明「是什麼」以及「如何運作」。

一、泛素－蛋白酶體系統

此系統適合分解許多細胞質與細胞核內的蛋白質，例如短半衰期調控蛋白、受損或錯誤摺疊的蛋白質。

運作步驟如下：

1. **泛素活化：**泛素活化酶 E1 消耗 ATP，活化泛素。
2. **泛素轉移：**泛素接著轉移至泛素結合酶 E2。
3. **受質辨識與接合：**泛素連接酶 E3 辨識特定受質，協助將泛素接到受質蛋白上。E3 對受質的辨識是此系統選擇性的關鍵。
4. **形成多聚泛素鏈：**受質上的泛素可逐步連接成多聚泛素鏈；常見的 K48 型多聚泛素鏈可作為送往蛋白酶體的訊號。
5. **蛋白酶體分解：**26S 蛋白酶體的 19S 調節顆粒辨識多聚泛素標記，移除並回收泛素，再消耗 ATP 將受質展開、送入 20S 核心顆粒。20S 核心以蛋白酶活性將蛋白質切成較短胜肽。

核心觀念

蛋白質轉譯後修飾（posttranslational modification, PTM）是蛋白質合成後，經酵素在特定胺基酸殘基上加上或移除化學基團，藉此調節蛋白質的活性、位置、穩定性或與其他分子的交互作用。

本題可用磷酸化作答。蛋白質激酶（protein kinase）將磷酸基加到蛋白質的絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸殘基上；蛋白質磷酸酶（protein phosphatase）則移除磷酸基。兩類酵素共同調節磷酸化程度，使訊號能被開啟、改變或終止。

解題方法

作答時依序交代「修飾內容、負責酵素、調控效果」：

1. **加入磷酸基：**蛋白質激酶以 ATP 為磷酸基來源，將磷酸基轉移至受質蛋白的特定殘基，並產生 ADP。
2. **移除磷酸基：**蛋白質磷酸酶水解磷酸化蛋白上的磷酸基，使受質回到未磷酸化狀態。

核心觀念

蛋白質轉譯後修飾（post-translational modification, PTM）是蛋白質合成後發生的化學修飾，例如磷酸化、乙醯化、泛素化與醣基化。PTM 可改變蛋白質的活性、穩定性、細胞內定位、交互作用或降解速率。

本題要提出三種可實際操作的技術，並說明如何用它們判定特定 PTM 是否存在，以及它對蛋白質功能造成什麼影響。完整實驗思路是：定位並確認修飾、改變修飾狀態、測量功能結果。

解題方法

1. 液相層析串聯質譜（LC-MS/MS）：定位並確認修飾位點

免疫沉澱目標蛋白後，將蛋白質酵素切割成胜肽，再以 LC-MS/MS 分析胜肽的質量變化與碎片訊號，確認 PTM 的種類及其所在胺基酸位點。若要比較處理條件或不同樣本間的修飾量，可使用定量質譜方法。

質譜能提供位點層級的證據；若要確認修飾是否隨細胞刺激或酵素處理改變，應設置適當的處理組與對照組。

2. 位點專一性突變：測試 PTM 位點是否具有因果作用

以定點突變建立野生型蛋白及修飾位點突變體，再於細胞中表現並比較其功能。突變設計依 PTM 種類而定，例如磷酸化研究常以 Ser、Thr 或 Tyr 的非磷酸化型突變作為比較；泛素化研究常針對受修飾的 Lys 進行突變。

核心觀念

本題考查如何從基因剔除後的表現變化，提出可檢驗的假說，並用分子生物學實驗判斷基因 $XX$ 如何調控蛋白質 $YY$。$YY$ 不由 $XX$ 編碼，表示兩者是不同基因的產物；觀察到剔除 $XX$ 後 $YY$ 蛋白量上升，支持 $XX$ 在正常情況下對 $YY$ 有負向調控作用，但單憑此現象尚不能判定調控發生於染色質、轉錄、mRNA 穩定性、翻譯或蛋白質降解。

可用下列關係整理各層次的可能機制：

• $YY$ 的蛋白量會受到轉錄與 mRNA 穩定性的影響，也會受到翻譯效率與蛋白質穩定性的影響。
• $YY$ mRNA 上升，表示調控可能位於轉錄或 mRNA 穩定性層次。
• $YY$ mRNA 不變、蛋白量上升，則應優先檢查翻譯效率或蛋白質降解速率。

解題方法

先確認 $XX$ 剔除與 $YY$ 上升的結果可重現，再用互補實驗測試兩者是否具有因果關係，接著比較 $YY$ 在染色質、mRNA 與蛋白質層次的變化。此順序能先排除技術誤差，再逐步定位調控層次。

假說

假說：$XX$ 是 $YY$ 的負向調控因子；正常細胞中的 $XX$ 會降低 $YY$ 的表現。剔除 $XX$ 後，$YY$ 增加。此負向調控可發生於染色質與轉錄層次，也可發生於 mRNA 穩定性、翻譯或蛋白質穩定性層次。

實驗設計與判讀

一、確認剔除結果，並以回補測試因果關係

以至少兩條獨立的 CRISPR guide RNA 建立 $XX$ 剔除細胞，確認 $XX$ 的基因組突變及 mRNA 或蛋白質下降；再以 Western blot 或定量蛋白質分析確認 $YY$ 上升。另設未處理或非靶向 guide RNA 對照，並在多株乳癌細胞中重複。

接著將不受該 guide RNA 影響的 $XX$ 表現載體導入剔除細胞，進行 回補實驗。若回補 $XX$ 後 $YY$ 蛋白量下降，支持 $XX$ 缺失與 $YY$ 上升之間具有因果關係。若不同 guide RNA 或獨立細胞株結果不一致，須考慮脫靶效應或細胞株差異。

二、測量 $YY$ mRNA，區分轉錄／mRNA 層次與蛋白質層次

以 RT-qPCR 或 Northern blot 測量野生型與 $XX$ 剔除細胞的 $YY$ mRNA，並同時以 Western blot 定量 $YY$ 蛋白。

• 若 $YY$ mRNA 與蛋白質皆上升，表示變化發生在蛋白質累積之前，應進一步檢查轉錄或 mRNA 穩定性。
• 若 $YY$ mRNA 不變，但蛋白質上升，表示需優先檢查翻譯效率或蛋白質穩定性。

RT-qPCR 應使用適當的內參基因，蛋白質分析則使用穩定的上樣對照，並以生物重複確認差異。

三、檢查染色質與轉錄調控

若 $YY$ mRNA 上升，可用 ChIP-qPCR 檢查 $YY$ 啟動子或候選調控區域的轉錄活化標記，例如 H3K27ac；也可檢查與轉錄抑制相關的組蛋白標記。

核心觀念

這題考查利用可偵測標記觀察蛋白質在細胞中的位置與動態變化。若要觀察活細胞中的蛋白質，可將目標蛋白與螢光蛋白融合；螢光訊號所在的位置，即可用來判斷目標蛋白的細胞內分布。

解題方法：以 GFP 融合蛋白為例

1. 將目標蛋白的基因與綠色螢光蛋白 GFP 的基因接合，設計成同一個開放閱讀框，使兩者可翻譯成一條融合蛋白。融合位置須避免干擾目標蛋白的重要功能或定位訊號。
2. 將構築好的基因導入細胞並表現。新合成的融合蛋白會保留目標蛋白的定位特性，同時帶有 GFP 的螢光。
3. 使用螢光顯微鏡以適當波長激發 GFP，並收集其發出的螢光。觀察螢光分布即可定位蛋白；例如，螢光集中在細胞核，表示融合蛋白主要分布於細胞核。

核心觀念

這題考查真核細胞膜蛋白的膜系統生合成、囊泡運輸與內吞回收。細胞膜蛋白通常不是在質膜上直接製造，而是先在粗糙內質網合成，再經由高基氏體與囊泡運送至質膜；抵達質膜後，蛋白質可經內吞進入內體，依細胞需求回收至質膜或送往溶酶體分解。

此路徑的重要原則是：膜蛋白在內質網中的拓樸方向，會沿囊泡運輸路徑保留。因此，內質網腔側的蛋白區域在質膜上朝向細胞外；朝向細胞質的區域則持續朝向細胞質。

解題方法

可依序追蹤膜蛋白的生命歷程：合成與插膜 → 修飾與分選 → 運送至質膜 → 內吞與回收或降解。

1. 內質網合成與插膜
   膜蛋白的翻譯從細胞質中的核糖體開始。新生多肽上的訊號序列或跨膜區段被辨識後，核糖體經由訊號辨識顆粒（SRP）導引至粗糙內質網。多肽接著經由轉位子進入內質網膜或內質網腔；跨膜區段使蛋白質嵌入膜中。單次或多次跨膜蛋白的拓樸，會由訊號序列與跨膜區段的排列決定。

2. 內質網與高基氏體的成熟及分選
   蛋白質在內質網中摺疊，並接受品質管制；許多蛋白質也會在此進行初步的醣基化等修飾。完成內質網階段後，蛋白質裝入運輸囊泡，送往高基氏體，在高基氏體中進一步修飾、分選並包裝。