114 年 國立成功大學微生物及免疫學研究所乙組《分子生物學》

本題主要在考察學生對真核生物基因表現（從基因到蛋白質）的分子機制的理解。這是一個涵蓋轉錄（transcription）和轉譯（translation）兩個核心過程的綜合性問題。

核心觀念： 基因表現是將 DNA 中的遺傳訊息轉譯成功能性蛋白質的過程，在真核生物中，這個過程涉及複雜的多步驟調控。

解題步驟：

1. 概述基因表現流程： 從 DNA 到 RNA 再到蛋白質。
2. 詳細闡述轉錄（Transcription）：
   • 啟動子（Promoter）與轉錄因子（Transcription Factors）： 說明轉錄起始複合物（transcription initiation complex）如何組裝，包括一般轉錄因子（general transcription factors, GTFs）和特定轉錄因子（specific transcription factors）的作用。
   • RNA聚合酶II（RNA Polymerase II）： 說明其在啟動子區域結合並開始合成 mRNA 前驅物（pre-mRNA）。
   • 轉錄延長（Elongation）： 描述 RNA 聚合酶 II 如何沿著 DNA 模板鏈移動，合成 5' 到 3' 方向的 RNA。
   • 轉錄終止（Termination）： 說明真核生物中轉錄終止的機制（通常與 polyadenylation 訊號有關）。
3. 詳細闡述轉錄後修飾（Post-transcriptional Modification）： 說明 pre-mRNA 在細胞核內被加工的過程，以形成成熟的 mRNA。
   • 5' 端加帽（5' Capping）： 說明 7-methylguanosine 帽的添加，其功能包括保護 mRNA 免受核酸酶降解、促進 mRNA 輸出細胞核以及在轉譯時識別核糖體。
   • 3' 端加聚（3' Polyadenylation）： 說明 poly(A) 尾巴的添加，其功能包括穩定 mRNA、促進 mRNA 輸出細胞核以及在轉譯時識別核糖體。

本題考查對 MicroRNA (miRNA) 的定義及其生物學功能的理解。

核心觀念： miRNA 是一類小分子非編碼 RNA，在轉錄後層級調控基因表現，特別是透過抑制轉譯或誘導 mRNA 降解來影響基因沉默。

解題步驟：

1. 定義 MicroRNA (miRNA)：
   • 分子特性： miRNA 是一類長度約 20-24 個核苷酸的單鏈 RNA 分子。
   • 來源： 這些 RNA 分子最初由細胞核內的基因轉錄成稱為初級轉錄物（pri-miRNA）的長鏈 RNA，pri-miRNA 經過剪切形成約 70 個核苷酸的莖環結構的蛋白質前體（pre-miRNA）。
   • 加工： pre-miRNA 在細胞質中被 Dicer（一種 RNase III 酶）進一步剪切，產生成熟的雙鏈 miRNA。
   • 功能性單鏈： 在 RISC (RNA-induced silencing complex) 複合物中，miRNA 的其中一條鏈（稱為引導鏈，guide strand）被保留，另一條鏈（乘客鏈，passenger strand）則被降解。
   • 非編碼 RNA： miRNA 本身不編碼蛋白質，而是作為調控因子。

本題要求舉例說明一種轉譯後修飾（Post-Translational Modification, PTM）如何調控蛋白質的功能。

核心觀念： 蛋白質在合成後，通過共價修飾或化學基團的添加，可以改變其結構、穩定性、細胞定位、與其他分子的交互作用，進而調控其生物學功能。

解題步驟：

1. 選擇一種轉譯後修飾： 選擇一種常見且功能明確的 PTM 作為例子。常見的 PTM 包括磷酸化（phosphorylation）、乙醯化（acetylation）、甲基化（methylation）、泛素化（ubiquitination）、糖基化（glycosylation）、SUMO 化（SUMOylation）等。這裡我們以磷酸化為例，因為它在信號傳導中極為普遍且重要。

2. 闡述所選 PTM 的機制：

   • 磷酸化 (Phosphorylation)：
     • 定義： 在蛋白質上特定胺基酸殘基（通常是絲胺酸 Ser, 蘇胺酸 Thr, 或酪胺酸 Tyr）上添加一個磷酸基團（-PO$_4^{3-}$）。
     • 催化酶： 由激酶（kinases）催化。
     • 去磷酸化： 由磷酸酶（phosphatases）催化，移除磷酸基團。
     • 可逆性： 磷酸化是高度可逆的過程，這使得它非常適合用於快速的信號傳導。

3. 舉例說明其如何調控蛋白質功能：

   • 例子：細胞週期調控中的 CDK (Cyclin-Dependent Kinase)
     • 背景： 細胞週期進程由一系列的 CDK 酶催化，這些 CDK 的活性受到其結合的週期蛋白（cyclins）以及一系列的磷酸化和去磷酸化事件的精確調控。
     • 調控機制：

本題要求設計實驗來驗證一個假設：蛋白質 X 是一個轉錄因子，能夠調控基因 Y 的表現。這需要結合分子生物學和遺傳學的實驗技術。

核心觀念： 轉錄因子（TF）是能與 DNA 上的特定序列（通常是啟動子或增強子）結合，並影響下游基因轉錄的蛋白質。驗證一個 TF 的功能，需要證明其能結合目標 DNA，並能影響目標基因的轉錄活性。

實驗設計步驟：

第一階段：證明蛋白質 X 與基因 Y 的調控區域（如啟動子）有結合能力。

1. 體外結合實驗 (In Vitro Binding Assay)：

   • 方法： 膠體滯留分析 (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) 或 DNA 拉 પ્રવૃત્તિ (DNA Pulldown Assay)。
   • 實驗內容：
     • EMSA： 純化蛋白質 X，並合成基因 Y 啟動子區域或其潛在結合位點（如猜測的 TFBS - Transcription Binding Site）的標記 DNA 探針（如放射性同位素標記或螢光標記）。將蛋白質 X 與 DNA 探針在體外混合。如果蛋白質 X 能結合 DNA，則會形成蛋白質-DNA 複合物，其電泳遷移率會比單獨的 DNA 探針慢。可透過加入過量的非標記 DNA（競爭實驗）或特定抗體（超移反應）來確認結合的特異性。
     • DNA Pulldown： 將基因 Y 啟動子區域的 DNA 片段進行生物素化（biotinylation）。將這些標記的 DNA 片段與純化的蛋白質 X 混合。然後，使用鏈黴親和素（streptavidin）磁珠來捕獲生物素化的 DNA-蛋白質複合物。洗去未結合的物質後，通過 Western Blot 檢測磁珠上是否富集了蛋白質 X，以此證明蛋白質 X 能與基因 Y 的啟動子結合。

2. 細胞內結合實驗 (In Vivo Binding Assay)：

   • 方法： 染色質免疫沉澱實驗 (Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)。
   • 實驗內容：
     • 在細胞培養過程中，可以透過甲醛（formaldehyde）交聯，將細胞內蛋白質與 DNA 的結合固定。
     • 使用針對蛋白質 X 的特異性抗體，免疫沉澱含有蛋白質 X 的 DNA-蛋白質複合物。
     • 釋放並純化免疫沉澱下來的 DNA 片段。
     • 透過定量 PCR (qPCR) 或 DNA 定序（ChIP-seq）來檢測這些 DNA 片段中是否富集了基因 Y 的啟動子區域或其潛在的結合位點。如果富集程度顯著高於對照基因（如無關基因的啟動子），則證明蛋白質 X 在細胞內確實能結合到基因 Y 的調控區域。

本題要求簡要描述或定義四個重要的細胞生物學術語。

核心觀念： 這四個術語分別代表了細胞生命週期中的關鍵過程、染色質結構、細胞內物質降解機制以及染色體末端的結構。

解題步驟：

1. Cell cycle (細胞週期):

   • 定義： 細胞週期是指一個細胞從一次分裂完成到下一次分裂完成所經歷的一系列事件。它是一個高度有序的循環過程，確保細胞能夠準確地複製其遺傳物質並將其分配給子細胞。
   • 主要階段： 包括間期 (Interphase) 和分裂期 (M phase)。
     • 間期 (Interphase)： 細胞生長和 DNA 複製的階段。又分為 G1 期 (Gap 1, 細胞生長)、S 期 (Synthesis, DNA 複製) 和 G2 期 (Gap 2, 細胞為分裂做準備)。
     • M 期 (M phase)： 包括核分裂 (mitosis) 和細胞質分裂 (cytokinesis)。
   • 調控： 細胞週期受到嚴格的檢查點（checkpoints）調控，以確保 DNA 完整性和正確的染色體分離。

2. Heterochromatin (異染色質):

   • 定義： 異染色質是真核細胞核內染色質的一種高度濃縮、緊密堆積的狀態。
   • 特性：
     • 結構： 相較於常染色質 (euchromatin)，異染色質在光學顯微鏡下呈現深色染色。
     • 基因活性： 通常被認為是基因不活躍或沉默的區域，因為其緊密結構阻礙了轉錄因子和 RNA 聚合酶接近 DNA。
     • 類型： 分為組成型異染色質 (constitutive heterochromatin)，在細胞週期中始終保持異染色質狀態（如著絲粒 centromere 和端粒 telomere 附近區域），以及兼性異染色質 (facultative heterochromatin)，其狀態會隨細胞類型或發育階段而變化（如 X 染色體失活）。