113 年 國立成功大學生理學研究所《分子生物學》

本題主要考驗學生對於 quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 技術的理解，包含其基本原理、RNA 樣品處理、以及引子設計的關鍵考量。

核心觀念：
qRT-PCR 是一種量化 RNA 表達量的技術，其核心步驟包括 RNA 的提取、反轉錄 (cDNA 合成) 以及 PCR 擴增與即時偵測。引子設計是確保 PCR 反應專一性與效率的關鍵。

解題步驟：

1. 從 RNA 進行分析的步驟：

   • RNA 提取 (RNA Extraction)： 首先需要從細胞或組織樣本中提取總 RNA (total RNA)。這通常涉及細胞裂解、RNA 純化（利用 RNase 抑制劑保護 RNA 不被降解）等步驟。
   • RNA 質量與定量 (RNA Quality and Quantification)： 提取的 RNA 需要評估其質量（例如使用分光光度計測量 A260/A280 比值，或使用電泳檢測 28S 和 18S rRNA 的完整性）和定量 (concentration)。
   • 反轉錄 (Reverse Transcription)： RNA 是單股 RNA 分子，無法直接作為 PCR 的模板。因此，需要使用反轉錄酶 (reverse transcriptase) 將 RNA 反轉錄成互補的 DNA (complementary DNA, cDNA)。此步驟通常使用隨機引子 (random primers) 或寡聚 (oligo-dT) 引子來起始 cDNA 合成。
   • 定量 PCR (Quantitative PCR, qPCR)： 合成的 cDNA 將作為 PCR 的模板，與設計好的特定基因引子一起進行 PCR 擴增。qRT-PCR 使用螢光染料 (如 SYBR Green) 或螢光標記的探針 (probe) 來偵測 PCR 產物的累積。螢光訊號的強度與 PCR 循環數的關係被即時監測，用以定量起始的 RNA 模板量。通過與已知濃度的標準品比較，或使用內參基因 (housekeeping gene) 進行相對定量，可以得出目標基因 RNA 的表達水平。

2. 設計專一的引子 (Primer Design)：
   引子是短的單股 DNA 分子，能夠與模板 DNA 序列結合，並作為 DNA 聚合酶延伸的起始點。為了準確量化特定基因的 RNA 表達，引子必須高度專一，只擴增目標基因的 cDNA。

本題主要考驗學生對基因剔除小鼠模型的理解，特別是兩種主要類型——全身性基因剔除和條件式基因剔除，以及條件式基因剔除在組織專一性和時間依賴性方面的實現方式。

核心觀念：
基因剔除小鼠是透過基因工程技術，使特定基因失活，進而研究該基因在生理和病理過程中的功能。全身性基因剔除會影響整個生物體，而條件式基因剔除則能控制基因失活發生的時間或部位，提供更精確的研究工具。

解題步驟：

1. 全身性基因剔除 (Constitutive Knockout)：

   • 定義： 在動物生命週期的所有細胞、所有時間點，該基因的功能都被永久性地、普遍地剔除或失活。
   • 實現方式： 通常透過胚胎幹細胞 (embryonic stem cells, ESCs) 在體外進行基因打靶 (gene targeting)，將目標基因的 DNA 序列替換為無功能的序列（如抗生素抗藥性基因），然後將改造過的 ESCs 注射到早期胚胎 (blastocyst) 中，再將胚胎植入代孕母鼠。由此產生的子代小鼠，其體細胞和生殖細胞中的目標基因都會被剔除。
   • 優缺點： 優點是能快速獲得基因剔除的表型。缺點是，如果該基因在胚胎發育早期就至關重要，則可能導致胚胎致死，無法產生存活的成年小鼠；或者，剔除該基因可能引發其他基因的代償性反應，使表型難以歸因於單一基因。

2. 條件式剔除 (Conditional Knockout, cKO)：

   • 定義： 該基因的剔除不是永久或全身性的，而是可以被特定條件（如特定組織、特定細胞類型、或特定時間點）所控制。
   • 實現方式 (Cre-loxP 系統)： 目前最常用的條件式剔除系統是基於 Cre 重組酶 (Cre recombinase) 和 loxP 位點 (locus of X-P1) 的組合。
     • loxP 位點： 是一種 34 bp 的 DNA 序列，包含一個 8 bp 的核心序列和兩個 13 bp 的迴文序列。Cre 重組酶能夠識別並切割 loxP 位點之間的 DNA 序列。
     • Cre 重組酶： 是一種來自噬菌體的酶，能夠在兩個 loxP 位點之間催化 DNA 的重組，導致中間序列的刪除 (deletion)、倒轉 (inversion) 或轉位 (translocation)。
   • 如何達成 cKO：
     • 首先，需要創建帶有 loxP 位點「側翼」包圍目標基因的「flox化」(flox化, floxed) 小鼠。這表示目標基因的關鍵區域（例如外顯子）被兩個 loxP 位點所夾持。
     • 然後，將這種「flox化」小鼠與另一種轉基因小鼠雜交，這種小鼠表達 Cre 重組酶。Cre 的表達模式（由其啟動子決定）將決定基因剔除的時機和地點。

3. 達成專一組織的條件式剔除 (Tissue-Specific Conditional Knockout)：

   • 原理： 讓 Cre 重組酶僅在目標組織或細胞中表達。
   • 實現方式：

本題主要考驗學生對細胞內中心法則 (Central Dogma) 中兩個關鍵過程——轉錄和轉譯的理解，以及它們發生的細胞位置和參與的分子機制。

核心觀念：
中心法則描述了遺傳信息的流動方向：DNA → RNA → Protein。轉錄是將 DNA 序列的信息轉錄成 RNA (主要是 mRNA) 的過程；轉譯是將 mRNA 序列的信息翻譯成蛋白質氨基酸序列的過程。

解題步驟：

1. 轉錄 (Transcription)：

   • 定義： 在細胞核內，以 DNA 為模板，合成互補的 RNA 分子（主要是信使 RNA, mRNA）的過程。
   • 發生位置： 真核細胞中主要發生在細胞核 (nucleus)。原核細胞沒有細胞核，轉錄和轉譯同時發生在細胞質中。
   • 主要參與者：
     • DNA 模板： 提供遺傳信息的 DNA 序列。
     • RNA 聚合酶 (RNA Polymerase)： 負責催化 RNA 合成的關鍵酶。在真核細胞中，有幾種類型的 RNA 聚合酶，其中 RNA 聚合酶 II 負責合成 mRNA。
     • 轉錄因子 (Transcription Factors)： 一類蛋白質，能夠識別 DNA 上的特定啟動子 (promoter) 和增強子 (enhancer) 序列，並與 RNA 聚合酶結合，調控轉錄的起始、延伸和終止。
   • 過程簡述：
     • 起始 (Initiation)： 轉錄因子識別並結合到 DNA 上的啟動子區域，幫助 RNA 聚合酶結合到啟動子處，解開 DNA 雙螺旋，形成轉錄泡 (transcription bubble)。
     • 延伸 (Elongation)： RNA 聚合酶沿著 DNA 模板鏈移動，以 DNA 序列為模板，按照鹼基互補配對原則 (A-U, G-C)，合成一條新的 RNA 鏈。RNA 鏈的方向是 5' 端到 3' 端。
     • 終止 (Termination)： 當 RNA 聚合酶遇到 DNA 上的終止信號序列時，轉錄反應停止，新合成的 RNA 分子從 DNA 模板和 RNA 聚合酶上釋放。
   • 真核細胞特有的轉錄後修飾 (Post-transcriptional Modification)：
     • 加帽 (5' Capping)： 在新合成 mRNA 的 5' 端加上一個特殊的鳥糞嘌呤核苷酸 (7-methylguanosine)，這有助於 mRNA 的穩定性、運輸以及與核糖體的結合。
     • 加尾 (3' Polyadenylation)： 在 mRNA 的 3' 端添加一串聚腺苷酸鏈 (poly-A tail)，這也有助於 mRNA 的穩定性、運輸和翻譯效率。
     • 剪接 (Splicing)： 去除 mRNA 前體 (pre-mRNA) 中的非編碼區（內含子, introns），將編碼區（外顯子, exons）連接起來，形成成熟的 mRNA。

2. 轉譯 (Translation)：

   • 定義： 在細胞質中，以 mRNA 為模板，利用核糖體 (ribosome) 和轉運 RNA (tRNA)，將 mRNA 的密碼子 (codon) 序列翻譯成蛋白質氨基酸序列的過程。
   • 發生位置： 真核細胞和原核細胞都發生在細胞質 (cytoplasm)，具體地點是核糖體 (ribosome)。
   • 主要參與者：
     • mRNA 模板： 攜帶遺傳密碼（由三個鹼基組成一個密碼子）的信使 RNA。
     • 核糖體 (Ribosome)： 由核糖體 RNA (rRNA) 和蛋白質組成，是蛋白質合成的場所。核糖體有兩個亞基（大亞基和小亞基），它們結合在一起形成功能性的核糖體，其中包含 A 位點 (aminoacyl site)、P 位點 (peptidyl site) 和 E 位點 (exit site)，用於結合 tRNA 和肽鏈。
     • 轉運 RNA (tRNA)： 小分子 RNA，其一端帶有能識別 mRNA 密碼子的反密碼子 (anticodon)，另一端攜帶對應的氨基酸。

本題主要考驗學生對細菌基因調控機制，特別是原核生物乳糖操縱組 (lac operon) 的理解，包括其結構組成、調控元件以及在不同代謝物條件下的運作模式。

核心觀念：
操縱組 (operon) 是原核生物基因組織的一種形式，指一組在功能上相關的基因，它們被一個共同的啟動子 (promoter) 和操縱子 (operator) 所控制，並由一個共同的調節基因 (regulatory gene) 所調控。乳糖操縱組是調節細菌代謝乳糖的基因系統。

解題步驟：

1. 乳糖操縱組 (Lactose Operon, lac operon) 的組成：
   lac operon 包含以下幾個關鍵組成部分：

   • 調節基因 (Regulatory Gene)： lacI 基因，位於操縱組結構基因的下游，獨立於操縱組本身啟動子進行轉錄。它編碼一個乳糖操縱阻遏蛋白 (lac repressor)。
   • 操縱子 (Operator, O)： 一段位於啟動子下游、結構基因上游的 DNA 序列。乳糖操縱阻遏蛋白可以結合到操縱子上，阻斷 RNA 聚合酶與啟動子的結合，從而抑制轉錄。
   • 啟動子 (Promoter, P)： RNA 聚合酶結合並開始轉錄的 DNA 區域。
   • 結構基因 (Structural Genes)： 編碼參與乳糖代謝的酶。在 lac operon 中，有三個結構基因，它們被共同的啟動子和操縱子調控：
     • lacZ： 編碼 β-半乳糖苷酶 (β-galactosidase)，負責將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。
     • lacY： 編碼乳糖滲透酶 (lactose permease)，負責將乳糖運輸到細胞內。
     • lacA： 編碼硫代半乳糖苷轉乙醯酶 (thiogalactoside transacetylase)，其功能與乳糖代謝的直接關係尚不明確，但可能參與解毒。

2. 乳糖操縱組的運作方式（調控機制）：
   lac operon 的表達受到兩種主要調控：

   • 負調控 (Negative Regulation)： 由乳糖操縱阻遏蛋白 (lac repressor) 負責。
   • 正調控 (Positive Regulation)： 由 catabolite activator protein (CAP) 和環腺苷酸 (cAMP) 複合物負責，調控乳糖操縱組在葡萄糖缺乏時的表達水平。

3. 在葡萄糖充足的狀況下 (Glucose High)：

   • 葡萄糖充足 → cAMP 水平低： 當細胞內葡萄糖濃度高時，cAMP 的合成受到抑制，導致細胞內 cAMP 濃度低。
   • CAP-cAMP 複合物未形成： cAMP 濃度低，無法與 CAP 結合形成 CAP-cAMP 複合物。
   • CAP-cAMP 複合物無法結合啟動子： CAP-cAMP 複合物是乳糖操縱組的正調控因子，它能夠結合到啟動子附近的一個特定位點，增強 RNA 聚合酶與啟動子的結合效率，促進轉錄。如果沒有 CAP-cAMP 複合物，RNA 聚合酶與啟動子的結合效率很低。

本題考驗學生對於溶液濃度計算的基本能力，特別是 molarity (莫耳濃度) 與 mass (質量) 之間的轉換，以及單位換算。

核心觀念：

• 莫耳濃度 (Molarity, M)： 定義為每公升溶液中所含溶質的莫耳數。單位是 mol/L。
• 微莫耳濃度 (micromolar, µM)： $1 \text{ µM} = 10^{-6} \text{ mol/L}$。
• 莫耳質量 (Molar Mass)： 一莫耳物質的質量，單位是 g/mol。
• 質量 (Mass)： 物質的重量，單位是克 (g)。

解題步驟：

1. 理解題目要求：

   • 目標濃度：$2 \text{ µM}$
   • 目標體積：$500 \text{ mL}$
   • 溶質：食鹽 (NaCl)
   • NaCl 的分子量：$58 \text{ g/mol}$
   • 要求計算需要多少質量的 NaCl (單位：g)。

2. 單位換算：

   • 將濃度單位 µM 換算為 M：
     $2 \text{ µM} = 2 \times 10^{-6} \text{ mol/L}$
   • 將體積單位 mL 換算為 L：
     $500 \text{ mL} = 500 \times 10^{-3} \text{ L} = 0.5 \text{ L}$

3. 計算所需 NaCl 的莫耳數：
   根據莫耳濃度的定義：
   莫耳濃度 (M) = 莫耳數 (mol) / 體積 (L)
   因此，莫耳數 (mol) = 莫耳濃度 (M) × 體積 (L)
   所需 NaCl 的莫耳數 = $(2 \times 10^{-6} \text{ mol/L}) \times (0.5 \text{ L})$
   所需 NaCl 的莫耳數 = $1 \times 10^{-6} \text{ mol}$

本題考驗學生對於溶液稀釋計算的理解，特別是利用已知濃度的濃縮溶液來配製稀釋溶液。

核心觀念：
在溶液稀釋過程中，溶質的總量保持不變，只有溶劑的量改變。因此，我們可以利用以下公式：
$C_1 V_1 = C_2 V_2$
其中：

• $C_1$ 是起始濃度的濃度 (本題中是 95% 酒精)。
• $V_1$ 是需要取用的起始濃度溶液的體積。
• $C_2$ 是目標濃度的濃度 (本題中是 70% 酒精)。
• $V_2$ 是目標濃度溶液的總體積 (本題中是 1000 mL)。

解題步驟：

1. 理解題目要求：

   • 起始溶液濃度：$C_1 = 95\%$ (體積百分比，v/v)
   • 目標溶液濃度：$C_2 = 70\%$ (體積百分比，v/v)
   • 目標溶液總體積：$V_2 = 1000 \text{ mL}$
   • 要求計算需要取用多少體積的 95% 酒精 ($V_1$)。

2. 套用稀釋公式：
   $C_1 V_1 = C_2 V_2$
   $(95\%) \times V_1 = (70\%) \times (1000 \text{ mL})$

3. 解出 $V_1$：
   $V_1 = \frac{C_2 V_2}{C_1}$
   $V_1 = \frac{(70\%) \times (1000 \text{ mL})}{95\%}$
   $V_1 = \frac{70 \times 1000}{95} \text{ mL}$