111 年 國立成功大學生理學研究所《分子生物學》

此題主要在考驗學生對於核苷酸組成單元以及核酸鏈形成的基礎知識。

解題思路：

1. 核苷酸的組成： 首先要說明一個核苷酸的基本結構，包含磷酸基團、五碳糖（DNA 為去氧核醣，RNA 為核醣）以及含氮鹼基（A, T/U, G, C）。
2. 核苷酸的連結方式： 接著說明核苷酸之間是如何連結成鏈的，這涉及到磷酸二酯鍵（phosphodiester bond）的形成。
3. 磷酸二酯鍵的形成過程： 詳細解釋一個核苷酸的 5' 端磷酸基團如何與另一個核苷酸的 3' 端羥基（-OH）反應，在磷酸和兩個羥基之間形成共價鍵，並釋放出一個水分子。
4. 三核苷酸的形成： 說明這個過程重複兩次，即可將三個核苷酸連結起來，形成一個三核苷酸鏈。
5. 方向性： 強調核酸鏈具有方向性，通常以 5' 端到 3' 端表示。

詳解：
核苷酸是核酸（DNA 或 RNA）的基本組成單元。一個核苷酸主要由三個部分組成：

1. 磷酸基團（Phosphate group）： 通常是 1 到 3 個磷酸基團連接在五碳糖的 5' 碳原子上。
2. 五碳糖（Pentose sugar）： 在 DNA 中是去氧核醣（deoxyribose），在 RNA 中是核醣（ribose）。
3. 含氮鹼基（Nitrogenous base）： 包括腺嘌呤（Adenine, A）、鳥糞嘌呤（Guanine, G）、胞嘧啶（Cytosine, C），以及 DNA 中的胸腺嘧啶（Thymine, T）或 RNA 中的尿嘧啶（Uracil, U）。

此題考驗學生對真核生物轉錄（transcription）起始、延伸和終止過程的理解。

解題思路：

1. 定義與基本概念： 首先定義轉錄，並指出其在真核生物中的重要性，以及與原核生物轉錄的區別（例如，真核生物有三個 RNA 聚合酶，轉錄發生在細胞核內，產物需要進一步修飾）。
2. RNA 聚合酶： 簡述真核生物中主要的 RNA 聚合酶（Pol I, Pol II, Pol III）及其負責轉錄的基因類型。本題通常指 Pol II 負責 mRNA 的轉錄。
3. 轉錄起始（Initiation）：
   • 啟動子（Promoter）： 說明啟動子是 DNA 上的一個區域，是 RNA 聚合酶結合並開始轉錄的地方。
   • 核心啟動子（Core promoter）： 介紹核心啟動子的組成，如 TATA box（或 INR, DPE 等元件）。
   • 基本轉錄因子（General Transcription Factors, GTFs）： 說明 GTFs（如 TFIID, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH）如何與啟動子結合，並招募 RNA 聚合酶 II。
   • 預起始複合物（Pre-initiation complex, PIC）： 描述 GTFs 和 RNA Pol II 協同作用形成 PIC 的過程。
   • 解旋（Unwinding）： 說明 TFIIH 中的解旋酶（helicase）活性如何解開 DNA 雙螺旋，形成轉錄泡（transcription bubble）。
   • 磷酸化（Phosphorylation）： 提及 TFIIH 中的激酶（kinase）活性會磷酸化 RNA Pol II 的 C 端結構域（CTD），這對於從起始轉變為延伸至關重要。
4. 轉錄延伸（Elongation）：
   • RNA Pol II 的移動： 說明 RNA Pol II 在 DNA 模板鏈上沿著 3' → 5' 方向移動。
   • RNA 合成： 說明 RNA Pol II 使用 DNA 模板合成一條與編碼鏈（coding strand）序列相似（U替換T）的 RNA 分子，方向是 5' → 3'。
   • 前體 mRNA（pre-mRNA）： 指出真核生物轉錄產物是 pre-mRNA，需要進一步加工。
5. 轉錄終止（Termination）：
   • 終止信號： 說明 RNA Pol II 轉錄時，會遇到特定的 DNA 序列作為終止信號。
   • RNA 剪切與 Polyadenylation： 介紹在終止點附近發生的 RNA 剪切（cleavage）和多聚腺苷酸化（polyadenylation）事件，這些過程與終止信號有關，並且通常由特定的蛋白質複合物（如 CPSF, CstF）介導。
   • RNA Pol II 的釋放： 說明 RNA Pol II 在完成轉錄後，會被從 DNA 上釋放，結束轉錄過程。

詳解：
真核生物的基因轉錄是指將 DNA 上的基因序列訊息轉錄為 RNA 分子的過程，主要由 RNA 聚合酶 II（RNA Pol II）負責 mRNA 的合成。這個過程可以分為三個主要階段：起始、延伸和終止。

1. 轉錄起始 (Initiation)：

• 啟動子識別： 轉錄起始始於 RNA 聚合酶 II 及其輔助因子（稱為基本轉錄因子，General Transcription Factors, GTFs）識別基因的啟動子區域。

此題考驗學生對染色質結構（chromatin structure）如何調控基因表現（gene activity）的理解，這是表觀遺傳學（epigenetics）的核心概念之一。

解題思路：

1. 染色質的基本結構： 首先介紹染色質的基本組成，即 DNA 與蛋白質（主要是組蛋白，histones）結合形成的結構。DNA 纏繞在組蛋白周圍形成核小體（nucleosomes），這是染色質的基本重複單元。

2. 核小體與更高級結構： 說明核小體如何進一步纏繞和摺疊，形成更緊密的結構，如 30 nm 纖維，進而形成染色質纖維，最終濃縮成染色體。

3. 基因活性與染色質結構的關係： 強調染色質的緊密度（compaction）直接影響轉錄因子、RNA 聚合酶等蛋白質能否接近 DNA 模板，從而調控基因的開啟（active）或關閉（repressed）。

   • 鬆散的染色質（Euchromatin）： 結構相對開放，易於轉錄因子結合，通常與活躍的基因表現相關。
   • 緊密的染色質（Heterochromatin）： 結構高度濃縮，難以被轉錄因子接近，通常與基因沉默（gene silencing）相關。

4. 調控機制： 詳細闡述染色質結構如何被動態調控，主要通過以下兩種機制：

   • 組蛋白修飾（Histone Modifications）：
     • 乙醯化（Acetylation）： 說明組蛋白乙醯轉移酶（Histone Acetyltransferases, HATs）在組蛋白的 N 端尾巴上添加乙醯基（-COCH3），這會中和帶正電的賴胺酸殘基，減弱組蛋白與帶負電的 DNA 之間的靜電吸引，使染色質變得鬆散，有利於基因轉錄。反之，組蛋白去乙醯酶（Histone Deacetylases, HDACs）則移除乙醯基，使染色質緊縮，抑制基因轉錄。
     • 甲基化（Methylation）： 說明組蛋白甲基轉移酶（Histone Methyltransferases, HMTs）可以在組蛋白的賴胺酸或精胺酸殘基上添加甲基。甲基化的結果可以是促進或抑制基因轉錄，取決於具體的胺基酸殘基和甲基化的數量（單甲基、雙甲基、三甲基）。例如，H3K4me3 通常與活躍基因啟動子相關，而 H3K9me3 和 H3K27me3 則與基因沉默相關。
     • 磷酸化（Phosphorylation）、泛素化（Ubiquitination）等： 簡述其他修飾，如磷酸化（H3S10ph）和泛素化，它們也參與染色質結構的調控和基因表現的調節。
   • 染色質重塑複合物（Chromatin Remodeling Complexes）：
     • 說明這些蛋白質複合物利用 ATP 的水解能，改變核小體的位置、移除或重新組裝核小體，從而改變 DNA 與組蛋白的接觸，影響 DNA 的可及性。
     • 例如，某些複合物可以將核小體從基因啟動子區域推開，或將其滑動到其他位置，從而暴露 DNA 序列，允許轉錄因子結合。
   • DNA 甲基化（DNA Methylation）： 雖然主要不是直接修飾組蛋白，但 DNA 甲基化（特別是在 CpG 島上）通常與基因沉默相關，它會招募甲基化 DNA 結合蛋白（MBDs），進而招募 HDACs 等蛋白質，導致染色質緊縮和基因沉默。

5. 總結： 強調染色質結構的動態變化是基因調控的重要層面，通過組蛋白修飾和染色質重塑，細胞能夠精確地控制哪些基因在何時何地被開啟或關閉。

此題考驗學生對轉錄後基因表現調控（post-transcriptional control of gene expression）的掌握程度，重點在於轉錄完成後，到蛋白質合成之前的 RNA 分子所經歷的調控步驟。

解題思路：

1. 定義與重要性： 首先定義什麼是轉錄後調控，並說明其在真核生物中尤為重要，因為真核生物的轉錄和轉譯是分離的（細胞核與細胞質），且 mRNA 需要經過多重加工。

2. 主要調控層面： 將調控機制按順序或邏輯分成幾個主要層面：

   • mRNA 加工（mRNA Processing）： 這是真核生物 mRNA 轉錄後最核心的加工過程，包含：
     • 5' 端加帽（5' Capping）： 說明 7-甲基鳥糞嘌呤（7-methylguanosine）如何連接到 mRNA 的 5' 端，其作用（保護 mRNA 免受核酸酶降解、識別並結合核糖體、影響剪接）。
     • 3' 端多聚腺苷酸化（3' Polyadenylation）： 說明在 mRNA 3' 端添加一串腺嘌呤核苷酸（poly(A) tail），其作用（保護 mRNA 免受核酸酶降解、促進 mRNA 輸出細胞核、促進轉譯）。
     • 內含子剪接（Intron Splicing）： 說明內含子（introns）被移除，外顯子（exons）被連接起來形成成熟的 mRNA。
   • 選擇性剪接（Alternative Splicing）： 這是基於內含子剪接的一種高級調控。說明一個基因可以通過不同的組合方式剪接其外顯子，產生多種不同的蛋白質異構體（isoforms），這極大地擴展了蛋白質的多樣性。
   • mRNA 穩定性與降解（mRNA Stability and Degradation）：
     • 說明 mRNA 在細胞質中的壽命（half-life）是調控基因表現的重要因素。
     • 介紹影響 mRNA 穩定性的因素，如 poly(A) 尾巴的長度、序列元件（如 AU-rich elements, AREs）的存在。
     • 說明 mRNA 降解途徑，如脫腺苷酸化（deadenylation）、脫帽（decapping）和 5'→3' 或 3'→5' 核酸酶的降解。
   • mRNA 運輸（mRNA Transport）： 說明成熟的 mRNA 如何從細胞核運輸到細胞質，這個過程受到調控，可以選擇性地運輸某些 mRNA。
   • 微小 RNA (miRNA) 和小干擾 RNA (siRNA)：
     • 介紹這些非編碼 RNA 如何通過與靶 mRNA 結合，導致 mRNA 的降解或抑制其轉譯。
     • miRNA 通常與靶 mRNA 的 3' UTR 結合，引起抑制轉譯或降解。
     • siRNA 通常與靶 mRNA 序列有更精確的配對，主要引起 mRNA 的降解。
   • RNA 結合蛋白質（RNA-Binding Proteins, RBPs）：
     • 說明 RBPs 可以結合到 mRNA 的特定序列（如 UTRs），影響 mRNA 的穩定性、定位、運輸和轉譯效率。
     • 例如，某些 RBPs 可以保護 mRNA 免受降解，而另一些則促進降解。
   • mRNA 定位（mRNA Localization）： 說明特定的 mRNA 分子可以被運輸到細胞內的特定位置，以便在需要蛋白質的區域進行局部轉譯。

3. 總結： 強調這些轉錄後調控機制共同作用，精確地控制了細胞內蛋白質的合成水平和時機，是真核生物基因表現調控的關鍵環節。

詳解：
轉錄後調控（post-transcriptional control）是指在 DNA 轉錄成 RNA 後，但在 RNA 被轉譯成蛋白質之前，對基因表現進行的調控。在真核生物中，由於轉錄和轉譯在空間和時間上是分離的，並且 mRNA 需要經過複雜的加工過程，因此轉錄後調控扮演著極為重要的角色。以下是主要的轉錄後調控機制：

1. mRNA 加工 (mRNA Processing)：

• 5' 端加帽 (5' Capping)： 在轉錄起始後不久，新合成的 mRNA 分子 5' 端會被加上一個特殊的

核心觀念

本題考查：

1. 模板股與編碼股的判讀

   • 模板股沿 $3' \to 5'$ 方向被 RNA polymerase 讀取。
   • mRNA 沿 $5' \to 3'$ 方向合成。
   • mRNA 與模板股互補；mRNA 與編碼股序列相同，但將 $T$ 改為 $U$。

2. 轉錄起點與起始密碼子

   • 題目指定從模板股中第一個 $T$ 開始轉錄。
   • 翻譯通常從 mRNA 上的 $AUG$ 起始，並依此決定閱讀框。

3. 模板股突變對 mRNA 與翻譯的影響

   • 模板股鹼基改變時，mRNA 的互補鹼基也會改變。
   • 若突變破壞或新建立 $AUG$，可能改變翻譯起始位置與閱讀框。

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解題方法

題目給出的上股為：

$$5'-GTATCGTATGCATGCATCGTAGA-3'$$

下股為模板股：

$$3'-CATAGCATACGTACGTAGCATCT-5'$$

模板股中第一個 $T$ 位於第三個鹼基，因此 mRNA 從此處開始合成。將模板股由左至右逐一取互補鹼基：

模板股	$T$	$A$	$G$	$C$	$A$	$T$	$A$	$C$	$G$	$T$	$A$	$C$	$G$	$T$	$A$	$G$	$C$	$A$	$T$	$C$	$T$
mRNA	$A$	$U$	$C$	$G$	$U$	$A$	$U$	$G$	$C$	$A$	$U$	$G$	$C$	$A$	$U$	$C$	$G$	$U$	$A$	$G$	$A$

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(a) mRNA 序列

因此，mRNA 序列為：

$$\boxed{5'-AUCGUAUGCAUGCAUCGUAGA-3'}$$

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(b) 起始密碼子

由 mRNA 的 $5'$ 端開始搜尋 $AUG$：

$$5'-AUC\,GUA\,\underline{AUG}\,CAU\,GCA\,UCG\,UAG\,A-3'$$

第一個起始密碼子為：

$$\boxed{AUG}$$

其位置為 mRNA 第 $6$ 至第 $8$ 個核苷酸。從此處開始的閱讀框為：

$$AUG\ |\ CAU\ |\ GCA\ |\ UCG\ |\ UAG$$

其中 $UAG$ 為終止密碼子。

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(c) 模板股第一個 G 改為 C

模板股中的第一個 $G$ 是整段模板股的第 $5$ 個鹼基，對應到 mRNA 的第 $3$ 個鹼基。

原本：

$$\text{模板 }G \longrightarrow \text{mRNA }C$$

突變後：

$$\text{模板 }C \longrightarrow \text{mRNA }G$$

因此 mRNA 由：

$$5'-AUC\,GUAUGCAUGCAUCGUAGA-3'$$

變為：

$$5'-AUG\,GUAUGCAUGCAUCGUAGA-3'$$

此突變在 mRNA 最前端新形成一個 $AUG$：

$$\underline{AUG}\ |\ GUA\ |\ UGC\ |\ AUG\ |\ CAU\ |\ CGU\ |\ AGA$$

此題考驗學生對現代生物技術，特別是 mRNA 疫苗技術的理解。題目提供了背景閱讀材料，要求學生基於材料和自身知識回答問題。

解題思路：

1. 閱讀理解： 仔細閱讀提供的背景段落，提取關鍵資訊。段落提到了 COVID-19 疫苗的開發，並特別指出「nucleoside-modified messenger RNA vaccines appear the most attractive」。
2. 定義核苷酸修飾的 mRNA (a)：
   • 從「nucleoside-modified messenger RNA」這個詞組入手。
   • 「nucleoside」是指核苷（糖+鹼基）。「modified」表示修飾。
   • 「messenger RNA」是信使 RNA，攜帶基因訊息。
   • 結合起來，核苷酸修飾的 mRNA 指的是在 mRNA 分子中，其構成的核苷酸（或更準確地說，核苷）被化學修飾過的 mRNA。
   • 通常，這種修飾是指將天然的核苷酸（如尿苷酸 UMP）替換為修飾過的核苷酸（如假尿苷酸 pseudouridine, Ψ），以提高 mRNA 的穩定性、降低其免疫原性，並提高轉譯效率。
   • 雖然文本沒有詳細解釋，但這是該技術的關鍵特點，學生應具備相關知識。
3. 核苷酸修飾 mRNA 在 RNA 疫苗中的應用 (b)：
   • 段落提到「nucleoside-modified messenger RNA vaccines appear the most attractive」。
   • RNA 疫苗的原理是將編碼特定抗原（如 SARS-CoV-2 的刺突蛋白）的 mRNA 遞送到人體細胞。細胞利用這個 mRNA 作為模板合成抗原，從而誘導免疫反應。
   • 核苷酸修飾是為了克服天然 mRNA 的缺點：天然 mRNA 在體內容易被降解，且會觸發強烈的先天免疫反應（被視為外來物）。
   • 通過引入修飾核苷酸（如假尿苷酸），可以：
     • 提高穩定性： 使 mRNA 在體內更持久，能夠更有效地進行轉譯。
     • 降低免疫原性： 減少 mRNA 觸發的細胞因子釋放和炎症反應，避免過早清除或產生不良反應。
     • 提高轉譯效率： 促進細胞利用 mRNA 合成目標蛋白質。
   • 因此，核苷酸修飾的 mRNA 被用作疫苗的「有效載荷」，確保其能夠穩定地在細胞內表達目標抗原，並引發有效的免疫保護。

詳解：
本題考驗學生對 mRNA 疫苗技術的理解，特別是核苷酸修飾在其中的作用。

(a) 核苷酸修飾的 mRNA 是什麼？
核苷酸修飾的 mRNA（Nucleoside-modified mRNA）是指在 mRNA 分子的結構中，其構成的核苷酸（或更精確地說，是構成核苷的鹼基或糖部分）經過了化學上的修飾。

此題考驗學生對離子通道（ion channels）在感覺傳導中作用的理解，特別是與溫度和機械刺激相關的通道，以及科學家如何通過功能篩選（functional screening）等實驗方法發現這些基因。

解題思路：

1. 閱讀理解： 仔細閱讀提供的諾貝爾獎獲獎理由和相關背景介紹，提取關鍵資訊。重點關注 David Julius 和 Ardem Patapoutian 的研究內容。
2. 回答 (a)：
   • 尋找與「溫度感覺」（thermal sensation，包括熱和冷）相關的基因。文章提到 David Julius 發現了 TRPV1，它被「activated by temperatures perceived as painful」。隨後又發現了 TRPM8，是「cold-sensitive receptor」。因此，TRPV1 和 TRPM8 是溫度感覺的基因。
   • 尋找與「機械感覺」（mechanical sensation，包括觸覺、本體感覺）相關的基因。文章提到 Ardem Patapoutian 發現了 PIEZO1 和 PIEZO2，它們是「mechanically-activated ion channels」並作為「mechanical sensors」。
   • 題目要求「at least two genes responsible for temperature and mechanical sensation, respectively」。所以，溫度感覺至少需要兩個基因，機械感覺至少需要兩個基因。
3. 回答 (b)：
   • 比較方法：
     • David Julius (溫度感覺)：使用「cDNA library from sensory neurons」進行「functional screen」。他尋找能使細胞「confer capsaicin sensitivity」的基因，因為辣椒素（capsaicin）能引起熱痛感，他推測與熱痛感相關的離子通道可能對辣椒素敏感。篩選到了一個能編碼「novel ion channel (TRPV1)」的 cDNA。隨後，他和 Patapoutian 又獨立發現了 TRPM8。
     • Ardem Patapoutian (機械感覺)：使用「a mechanosensitive cell line」進行「functional screen」。他尋找被「mechanical stimuli」激活的離子通道。篩選到 PIEZO1 和 PIEZO2。
     • 共同點： 兩種研究都使用了「功能篩選」（functional screen）的方法。都從特定細胞（感覺神經元或機械敏感細胞系）的 cDNA 文庫中尋找候選基因。
     • 不同點： Julius 的篩選是基於對特定化學物質（辣椒素）的敏感性，並推測其與溫度有關；Patapoutian 的篩選是直接基於對機械刺激的響應。Julius 使用的是感覺神經元的 cDNA，而 Patapoutian 使用的是機械敏感細胞系。
   • 比較發現：
     • Julius 的發現： 發現了 TRPV1（熱敏感，對辣椒素敏感）和 TRPM8（冷敏感）。這些是 TRP（Transient Receptor Potential）離子通道家族的成員，在熱、冷、痛覺傳導中起關鍵作用。
     • Patapoutian 的發現： 發現了 PIEZO1 和 PIEZO2。它們屬於一個全新的離子通道類別，是主要的機械門控（mechanically gated）離子通道，負責感知機械刺激，如觸覺、本體感覺、內臟張力等。
     • 共同點： 都發現了新的離子通道，它們是感覺系統（熱、冷、機械）的分子轉導器。
     • 不同點： Julius 發現的是 TRP 家族通道，主要與熱、冷、痛有關；Patapoutian 發現的是 PIEZO 家族通道，主要與機械刺激有關。

詳解：
本題要求根據提供的背景材料，回答關於溫度和機械感覺相關基因的問題，並比較發現這些基因的方法和結果。

(a) 負責溫度和機械感覺的基因：
根據文章描述：

• 溫度感覺 (Temperature sensation)：
  • TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloid 1): David Julius 發現，它對引起灼熱感的溫度（高溫）敏感，並且能被辣椒素（capsaicin）激活。
  • TRPM8 (Transient Receptor Potential Melastatin 8): David Julius 和 Ardem Patapoutian 獨立發現，它是一種冷敏感受體。