112 年 國立成功大學生理學研究所《分子生物學》

核心觀念

本題考查核酸的三個結構層次：

1. 一級結構（primary structure）
2. 二級結構（secondary structure）
3. 三級結構（tertiary structure）

核酸的功能不只取決於核苷酸排列順序，也取決於單股或雙股鏈如何摺疊，以及整個分子在三維空間中的配置。

解題方法

題目問的是核酸的「三種重要結構」，直接依核酸結構層次作答即可。

1. 一級結構：核苷酸序列

一級結構是核酸鏈中核苷酸的排列順序。核苷酸之間以 3′–5′ 磷酸二酯鍵連接，形成具有方向性的多核苷酸鏈：

$$5' \rightarrow 3'$$

DNA 的鹼基為 A、T、G、C；RNA 的鹼基為 A、U、G、C。一級結構攜帶遺傳資訊，也決定後續鹼基配對與分子摺疊的可能方式。

2. 二級結構：局部鹼基配對與規則摺疊

二級結構是由鹼基間的互補配對形成的規則性結構，主要穩定力包括：

• 氫鍵
• 鹼基堆疊作用
• 疏水作用與范德華力

DNA 常形成反平行雙股螺旋，A 與 T 配對，G 與 C 配對。RNA 多為單股，但可藉由自身互補序列形成莖環、髮夾、內部環與假結等結構。

二級結構會影響：

本題考察 DNA 複製過程中，延遲股 (lagging strand) 的合成機制，這是 DNA 複製的關鍵概念之一。

DNA 複製是半保留式 (semiconservative) 的，意味著每複製一個 DNA 分子都會產生兩個新的 DNA 分子，每個分子都包含一個親代股和一個子代股。DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 只能沿著 5' 到 3' 的方向合成新的 DNA 鏈。由於 DNA 雙股是反向平行 (antiparallel) 的，其中一股（模板股，template strand）的讀取方向是 3' 到 5'，這使得新的子代鏈可以在此方向上連續合成，稱為前導股 (leading strand)。另一股模板股的讀取方向是 5' 到 3'，這意味著子代鏈必須沿著 5' 到 3' 的方向合成，但這與模板股的讀取方向相反。因此，延遲股的合成是斷斷續續的，形成稱為岡崎片段 (Okazaki fragments) 的小片段。

延遲股複製的步驟如下：

1. 引子合成 (Primer Synthesis)：由於 DNA 聚合酶無法從頭開始合成 DNA，因此需要一個 RNA 引子 (RNA primer) 來提供一個 3'-OH 末端。引子由引導酶 (primase) 合成。

本題要求解釋六個分子生物學中的重要術語。這些術語涵蓋了基因表達調控、RNA 處理、蛋白質合成起始以及 DNA 複製的準確性。

(a) promoter
定義：啟動子 (promoter) 是 DNA 序列中的一段區域，位於基因的起始端（通常在轉錄起始位點的上游）。它是 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 結合並開始轉錄的位點。
功能：啟動子包含一個或多個結合位點，供 RNA 聚合酶及其輔助因子（如轉錄因子）識別和結合。啟動子的序列決定了基因轉錄的頻率和起始點。
結構：在原核生物中，啟動子通常包含 -10 (Pribnow box) 和 -35 區域。在真核生物中，啟動子結構更複雜，可能包含 TATA box、CCAAT box 等，並需要多種轉錄因子的協同作用。

(b) activator
定義：活化因子 (activator) 是一種蛋白質，它能夠增強或促進基因的轉錄。
功能：活化因子通常與 DNA 上的特定序列（活化子，enhancer 或 upstream activating sequence, UAS）結合，然後通過與 RNA 聚合酶或其輔助因子相互作用，增加轉錄起始的效率。在真核生物中，活化因子經常與轉錄因子複合物結合，並可能招募染色質重塑酶 (chromatin remodeling enzymes) 來鬆弛染色質結構，使 DNA 更容易被轉錄機器接近。

(c) splicing
定義：剪接 (splicing) 是真核生物 mRNA 前體 (pre-mRNA) 加工過程中的一個重要步驟，它涉及將內含子 (introns) 移除，並將外顯子 (exons) 連接起來，形成成熟的 mRNA 分子。
機制：剪接主要由稱為剪接體 (spliceosome) 的大型 RNA-蛋白質複合物催化。剪接體識別內含子兩端的剪接位點 (splice sites)，然後通過一系列的 RNA 催化反應，將內含子切除，並將相鄰的外顯子連接起來。
重要性：剪接允許產生多種不同的 mRNA 分子（異構體，isoforms）從同一基因轉錄出來，這種現象稱為選擇性剪接 (alternative splicing)，大大增加了蛋白質的多樣性。

(d) start codon
定義：起始密碼子 (start codon) 是 mRNA 序列中的一個密碼子，它標誌著蛋白質合成（轉譯）的起始點。

本題要求列舉並說明三個調控基因表達的機制。基因表達調控是細胞生命活動的基礎，確保細胞在適當的時間、適當的地點、以適當的強度表達特定的基因。

以下是三個重要的基因表達調控機制：

1. 轉錄水平調控 (Transcriptional Regulation)：

   • 機制：這是基因表達調控最常見和最主要的層級。它通過調控 RNA 聚合酶與啟動子結合的效率來控制轉錄的起始。這包括：
     • 轉錄因子 (Transcription Factors)：特異性蛋白質，如活化因子 (activators) 和阻遏因子 (repressors)，可以與 DNA 上的啟動子或增強子 (enhancers) 序列結合，從而促進或抑制 RNA 聚合酶的活性。
     • 啟動子和增強子/沉默子 (Promoters and Enhancers/Silencers)：這些 DNA 區域的序列決定了轉錄因子的結合能力，進而影響基因的轉錄速率。
     • 染色質結構調控 (Chromatin Structure Regulation)：真核生物的 DNA 被包裝在染色質中。染色質的緊密程度（異染色質 vs. 常染色質）會影響 RNA 聚合酶的可及性。組蛋白修飾（如乙醯化、甲基化）和染色質重塑複合物可以改變染色質結構，從而調控基因表達。
   • 例子：在細菌中，操縱子 (operon) 模型（如 Lac operon）展示了阻遏蛋白和誘導物如何調控基因表達。在真核生物中，細胞分化、激素響應等都涉及複雜的轉錄調控網絡。

2. 轉譯後調控 (Post-translational Regulation)：

   • 機制：在蛋白質合成完成後，通過對蛋白質進行化學修飾或改變蛋白質的穩定性來調控其活性。這包括：

本題考察對古DNA研究領域的理解，特別是 Svante Pääbo 教授在古人類基因組學方面的貢獻，以及他所使用的關鍵分子生物學技術。

Svante Pääbo 教授因其在古基因組學領域的開創性工作而獲得諾貝爾獎，特別是他成功測序了尼安德特人 (Neanderthal) 的基因組，並發現了丹尼索瓦人 (Denisovan)。這些研究依賴於從古老樣本中提取和測序 DNA 的先進技術。

他所使用的分子方法主要包括：

1. 古 DNA 的提取與純化 (Ancient DNA Extraction and Purification)：

   • 挑戰：古 DNA 樣本（如骨骼、牙齒化石）通常受到環境因素（如水分、微生物、化學物質）的嚴重降解，DNA 鏈會斷裂成短片段，並且容易受到現代人類 DNA 的污染。
   • 方法：Pääbo 實驗室開發了嚴格的無菌操作程序，在高度清潔的實驗室環境中進行操作，以最大程度地減少現代 DNA 的污染。他們採用特殊的緩衝液和化學方法，從骨骼或牙齒的微量樣本中提取 DNA。由於古 DNA 含量極低且高度片段化，因此提取和純化步驟的效率和準確性至關重要。

2. DNA 定序技術 (DNA Sequencing Technologies)：

   • 早期方法 (Sanger Sequencing)：在早期研究中，可能使用了 Sanger 定序法來對短片段的 DNA 進行定序，但這對於龐大且高度片段化的古基因組來說效率不高。
   • 高通量定序 (High-Throughput Sequencing, HTS) / 次世代定序 (Next-Generation Sequencing, NGS)：這是 Pääbo 教授取得突破性成就的關鍵技術。NGS 技術，如 Illumina 平台，能夠大規模並行地定序數百萬甚至數十億個 DNA 片段。
     • 工作原理 (簡述)：
       1. DNA 文庫構建 (Library Preparation)：將提取的古 DNA 片段進行接頭連接 (adapter ligation)，形成 DNA 文庫。這些接頭包含用於 PCR 擴增和定序的序列。
       2. PCR 擴增 (PCR Amplification)：利用 PCR 技術對文庫中的 DNA 片段進行指數級擴增，以產生足夠的 DNA 量進行定序。
       3. 定序 (Sequencing by Synthesis)：在 NGS 平台上，DNA 聚合酶將帶有螢光標記的核苷酸添加到互補鏈上。