109 年 國立成功大學生理學研究所《分子生物學》

此題主要在探討轉錄後修飾中，一種重要的調控機制——選擇性剪接 (alternative splicing)，以及如何偵測此現象。

核心觀念：
選擇性剪接是真核生物中，一種能夠讓單一基因產生多種不同蛋白質異構物 (isoforms) 的過程。它透過在 RNA 剪接過程中，選擇性地保留或排除某些外顯子 (exons) 或內含子 (introns)，來產生不同的成熟 mRNA 分子。

詳解：

(a) 什麼是選擇性剪接 (alternative splicing)？

選擇性剪接是一種轉錄後修飾，發生在真核生物的 mRNA 前驅體 (pre-mRNA) 剪接過程中。在正常的剪接過程中，內含子會被移除，外顯子則會被連接起來形成成熟的 mRNA。然而，在選擇性剪接中，剪接體 (spliceosome) 會根據細胞的特定需求，選擇性地將某些外顯子包含或排除在最終的成熟 mRNA 中。這使得一個基因可以透過不同的剪接組合，編碼出結構和功能上有所差異的蛋白質異構物。

選擇性剪接的常見模式包括：

• 外顯子跳躍 (Exon skipping)： 某個外顯子被選擇性地移除。
• 內含子滯留 (Intron retention)： 某個內含子未被移除，並被包含在成熟 mRNA 中。
• 交替的 5' 或 3' 剪接位點 (Alternative 5' or 3' splice site)： 使用與標準剪接位點不同的剪接位點。
• 互斥外顯子 (Mutually exclusive exons)： 兩個或多個外顯子中，只有一個會被包含在成熟 mRNA 中。

(b) 如何偵測「選擇性剪接」？

偵測選擇性剪接的方法主要依賴於分析 mRNA 的序列或其表現模式。以下是幾種常用的方法：

1. RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 及凝膠電泳：

此題考查蛋白質轉譯後修飾 (post-translational modification, PTM) 的定義及其偵測方法。

核心觀念：
轉譯後修飾是指蛋白質在核糖體上合成（轉譯）完成後，所發生的一系列化學修飾。這些修飾對於蛋白質的正確摺疊、穩定性、活性、亞細胞定位、與其他分子的交互作用以及訊號傳導等都至關重要。

詳解：

(a) 什麼是轉譯後修飾 (post-translational modification, PTM)？

轉譯後修飾是細胞在蛋白質合成完成後，對蛋白質進行的各種化學修飾。這些修飾可以改變蛋白質的物理和化學性質，進而影響其功能。PTM 的種類非常多樣，常見的包括：

• 磷酸化 (Phosphorylation)： 在絲胺酸 (Ser)、蘇胺酸 (Thr) 或酪胺酸 (Tyr) 殘基上加入磷酸基團。這是最常見的 PTM，在細胞訊號傳導中扮演關鍵角色。
• 醣基化 (Glycosylation)： 在蛋白質上添加醣鏈。影響蛋白質的摺疊、穩定性、細胞表面識別和免疫反應。
• 乙醯化 (Acetylation)： 在離胺酸 (Lys) 的胺基上加入乙醯基。常見於組蛋白，影響基因表現。
• 甲基化 (Methylation)： 在離胺酸 (Lys) 或精胺酸 (Arg) 殘基上加入甲基。也常見於組蛋白。
• 泛素化 (Ubiquitination)： 將泛素蛋白連接到目標蛋白質的離胺酸殘基上。常導致蛋白質降解，但也參與其他細胞過程。
• 二硫鍵形成 (Disulfide bond formation)： 在兩個半胱胺酸 (Cys) 殘基之間形成共價鍵。有助於穩定蛋白質的結構，尤其是在分泌性蛋白質中。
• 水解 (Proteolytic cleavage)： 切割蛋白質鏈，例如將蛋白質原 (pro-protein) 轉化為活性形式。
• 脂質化 (Lipidation)： 添加脂質分子，如棕櫚醯化 (palmitoylation) 或肉豆蔻醯化 (myristoylation)，影響蛋白質的膜結合能力。

(b) 如何偵測「轉譯後修飾」？

偵測 PTM 需要專門的技術，因為 PTM 的種類繁多，且通常只發生在蛋白質的特定胺基酸殘基上。以下是幾種常用的偵測方法：

1. 質譜法 (Mass Spectrometry, MS)：
   • 這是目前偵測 PTM 最強大、最靈敏的技術之一。

本題要求列舉三種基因突變的例子，並說明如何偵測這些突變。

核心觀念：
基因突變是指 DNA 序列發生的永久性改變。突變可以是自發性的，也可以由環境因素（突變原，mutagens）引起。突變的類型多樣，影響也各不相同，從無影響到嚴重的疾病都可能發生。

詳解：

(a) 三個基因突變的例子：

1. 點突變 (Point Mutation)：

   • 定義： DNA 分子中單一鹼基對的改變，包括鹼基的替換 (substitution)、插入 (insertion) 或刪除 (deletion)。
   • 子類型：
     • 轉換 (Transition)： 嘌呤鹼基 (A, G) 替換為另一嘌呤，或嘧啶鹼基 (C, T) 替換為另一嘧啶。
     • 顛換 (Transversion)： 嘌呤鹼基替換為嘧啶鹼基，或反之。
     • 錯義突變 (Missense mutation)： 密碼子改變，編碼的胺基酸也改變。
     • 無義突變 (Nonsense mutation)： 密碼子改變為終止密碼子，導致蛋白質提前終止。
     • 同義突變 (Silent mutation)： 密碼子改變，但由於密碼子的簡併性，編碼的胺基酸不變。
     • 框移突變 (Frameshift mutation)： 由非三的倍數鹼基插入或刪除引起，改變後續所有密碼子的讀碼框架。

2. 染色體結構變異 (Chromosomal Structural Aberrations)：

   • 定義： 指染色體結構發生的改變，涉及較大的 DNA 片段。
   • 子類型：
     • 缺失 (Deletion)： 染色體某段的遺失。
     • 重複 (Duplication)： 染色體某段的重複。
     • 倒位 (Inversion)： 染色體某段的 DNA 序列發生 180 度翻轉。
     • 易位 (Translocation)： 染色體片段轉移到非同源染色體上。

3. 基因拷貝數變異 (Copy Number Variation, CNV)：

   • 定義： 指基因組 DNA 區域的拷貝數發生變異，即該區域的 DNA 片段被重複或缺失，導致拷貝數增加或減少。與染色體結構變異有關，但通常指較小的區域，且可能是多態性。
   • 影響： 影響基因表現量，進而影響表型。

(b) 如何偵測這些突變？

偵測基因突變的方法取決於突變的類型和規模。

1. 偵測點突變：
   • DNA 定序 (DNA Sequencing)：
     • Sanger 定序： 傳統方法，適用於檢測特定基因或小片段 DNA 的突變。先進行 PCR 擴增目標區域，再對 PCR 產物進行定序。

此題旨在探討哺乳動物細胞中調控鐵離子恆定的關鍵蛋白質，以及它們的表現量如何受鐵離子濃度影響。

核心觀念：
鐵離子對於細胞的許多生理功能至關重要，例如氧氣運輸（血紅素）和能量代謝（細胞色素）。然而，過量的鐵離子也會產生毒性（自由基）。因此，細胞發展出精密的機制來維持鐵離子的穩態（homeostasis），即在吸收、儲存、運輸和利用之間取得平衡。這個調控機制主要由兩個蛋白質家族負責：鐵調節蛋白 (Iron Regulatory Proteins, IRPs) 和它們的配體，即鐵反應元件結合蛋白 (Iron Responsive Element-Binding Proteins, IRE-BPs)，以及調控鐵吸收和儲存的蛋白質，如鐵蛋白 (ferritin) 和轉鐵蛋白受體 (transferrin receptor, TfR)。

詳解：

在哺乳動物細胞中，調控鐵離子恆定的兩個最直接且關鍵的蛋白質是：

1. 鐵調節蛋白 (Iron Regulatory Proteins, IRPs)，通常指 IRP1 和 IRP2。
2. 鐵蛋白 (Ferritin) 和 轉鐵蛋白受體 (Transferrin Receptor, TfR)，它們是 IRPs 的主要調控目標。雖然題目要求命名「兩個蛋白質」，但這兩個蛋白質（Ferritin 和 TfR）常被視為鐵恆定調控的下游執行者，與 IRPs 共同構成核心系統。如果嚴格要求兩個，通常會將 IRPs 視為一個系統，而 Ferritin 和 TfR 作為代表性的兩個下游目標。若要嚴格回答「兩個蛋白質」，可以聚焦於 IRP1/IRP2 和 Ferritin 或 TfR。這裡我們解釋 IRPs 的作用，以及 Ferritin 和 TfR 的響應。

蛋白質名稱與功能：

• 鐵調節蛋白 (IRPs)： IRPs 是一類細胞質蛋白，它們能夠識別並結合 mRNA 上稱為鐵反應元件 (Iron Responsive Elements, IREs) 的特定 RNA 結構。當細胞內鐵離子濃度較低時，IRPs 表現活性較高，能夠結合 IREs。當鐵離子濃度升高時，細胞內的鐵離子會結合到 IRPs 上，導致 IRPs 的活性降低，從而釋放 IREs。
• 鐵蛋白 (Ferritin)： 是一種儲存鐵離子的蛋白質。它能將細胞內過量的鐵離子儲存起來，以防止其產生毒性。
• 轉鐵蛋白受體 (Transferrin Receptor, TfR)： 位於細胞膜上，負責結合並內吞細胞外的運鐵蛋白 (transferrin) 攜帶的鐵離子。

Levels 的響應：

這兩個蛋白質（或蛋白質系統）的表現水平會根據細胞內鐵離子濃度的變化而進行精確調控：

1. 低鐵離子濃度時：
   • IRPs 活性升高： 由於細胞內缺乏鐵離子，IRPs 處於未結合鐵的狀態，具有較高的 RNA 結合活性。

本題要求繪製基因結構圖，並解釋其中各組成部分的結構與功能。

核心觀念：
基因結構是指基因在 DNA 中的序列組成，包括調控區域和編碼區域。這些區域在基因的轉錄和轉譯過程中具有特定的功能，共同決定了最終蛋白質的產生。

詳解：

(a) 繪製基因結構圖：

請參考以下示意圖，其中包含了所要求的各個組成部分。

      <------------------------ Transcription ------------------------>
      5'                                                              3'
      |-------------------|-------------------|-------------------|
      |                   |                   |                   |
      Promoter Region     Exon 1 | Intron 1 | Exon 2 | Intron 2 | Exon 3 | 3' UTR
      (Regulatory)        (Coding/UTR) (Non-coding) (Coding/UTR) (Non-coding) (Coding/UTR) (UTR)
                               ^                                    ^
                               |                                    |
                          Start Codon (AUG)                      Stop Codon (UAA/UAG/UGA)
                               |                                    |
      <------------------------ mRNA ------------------------>
      5'UTR | Exon 1 | Exon 2 | Exon 3 | 3'UTR
            ^        ^        ^
            |        |        |
         (UTR)    (Coding)   (UTR)

注意：

• 上圖展示了 DNA 基因結構，以及由其轉錄生成的 mRNA 結構。
• Promoter Region 位於基因的 5' 端上游，是調控轉錄的區域。
• Exons 是最終會被保留在成熟 mRNA 中的 DNA 序列，可能編碼蛋白質或位於 UTR 區域。
• Introns 是在 pre-mRNA 中會被剪接掉的 DNA 序列。
• 5' UTR 和 3' UTR 是位於成熟 mRNA 上，但在編碼區之外的區域。
• Start Codon (AUG) 標誌著蛋白質合成的起始，通常位於 Exon 內。
• Stop Codon (UAA, UAG, UGA) 標誌著蛋白質合成的終止，通常位於 Exon 內。

(b) 各部分的功能解釋：

1. Promoter Region (啟動子區域)：
   • 位置： 位於基因的 5' 端上游（upstream）。
   • 功能： 這是 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 和其他轉錄因子結合的 DNA 區域。它決定了基因何時、何地以及以何種效率進行轉錄。

本題要求描述真核生物 DNA 複製的過程。

核心觀念：
DNA 複製是細胞分裂前必須進行的過程，確保遺傳信息的準確傳遞給子代細胞。真核生物的 DNA 複製比原核生物更複雜，因為其基因組更大，線性染色體有多個複製起始點，並且與組蛋白的組織方式有關。

詳解：

真核生物的 DNA 複製是一個高度協調且複雜的過程，主要可以分為以下幾個階段和關鍵步驟：

1. 複製起始 (Replication Initiation)：

   • 多個複製起始點 (Multiple Origins of Replication)： 與原核生物的單一複製起始點不同，真核生物的線性染色體上有成千上萬個複製起始點 (origins of replication, ORIs)。這些起始點通常富含 A-T 鹼基對，便於解旋。
   • 識別和結合起始點： 在細胞週期的 S 期（DNA 合成期）開始時，一種稱為起源識別複合體 (Origin Recognition Complex, ORC) 的蛋白質複合體會識別並結合到複製起始點上。
   • 形成起始複合體： 在 ORC 的基礎上，其他蛋白質（如 Cdc6 和 Cdt1）會招募複製起始蛋白（如 MCM 複合體，MCM2-7，它是一個 DNA 解旋酶）形成複製起始複合體。這個過程受到細胞週期蛋白依賴性激酶 (Cyclin-dependent kinases, CDKs) 的嚴格調控，確保複製只在 S 期發生。
   • DNA 解旋： 一旦起始複合體形成並被激活，MCM 解旋酶會開始解開雙螺旋 DNA，形成複製叉 (replication fork)。

2. DNA 鏈的延伸 (DNA Elongation)：

   • 引導鏈 (Leading Strand) 和滯後鏈 (Lagging Strand) 的合成： DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 只能沿著 5' 到 3' 方向合成新的 DNA 鏈。由於 DNA 雙螺旋是反向平行的，在每個複製叉處，兩條母鏈的合成方式不同。
     • 引導鏈： 沿著複製叉前進的方向連續合成，僅需一個 RNA 引物 (primer)。
     • 滯後鏈： 沿著與複製叉前進方向相反的方向不連續合成，形成稱為岡崎片段 (Okazaki fragments) 的短 DNA 片段。每個岡崎片段都需要一個 RNA 引物。
   • RNA 引物的合成： DNA 聚合酶無法從頭開始合成 DNA，需要一個 RNA 引物來提供一個 3'-OH 末端。這個任務由一種特殊的 RNA 聚合酶——引物酶 (primase) 完成。
   • DNA 聚合酶的種類： 真核生物有多種 DNA 聚合酶。

本題考查三種重要的 DNA 修復途徑：鹼基切除修復 (BER)、核苷酸切除修復 (NER) 和非同源末端連接 (NHEJ)。

核心觀念：
DNA 在細胞代謝過程中不斷受到各種損傷，如化學修飾、錯誤摻入、斷裂等。細胞演化出多種 DNA 修復機制來維持基因組的完整性，防止突變累積和細胞死亡。BER 和 NER 主要修復鹼基損傷和核苷酸損傷，而 NHEJ 則修復 DNA 雙鏈斷裂。

詳解：

(a) 鹼基切除修復 (Base Excision Repair, BER)：

BER 主要用於修復由氧化、烷基化、脫氨基等引起的單個受損或異常鹼基。

1. 識別和切除受損鹼基： DNA 糖苷酶 (DNA glycosylase) 識別並切除受損鹼基與糖的糖苷鍵，在 DNA 骨架上留下一個無鹼基位點 (apurinic/apyrimidinic site, AP site)。真核生物有許多不同類型的 DNA 糖苷酶，每種專門識別特定的鹼基損傷。
2. AP 位點的處理： AP 核酸內切酶 (AP endonuclease) 識別 AP site，並切斷相鄰的磷酸二酯鍵，在 DNA 骨架上產生一個缺口。
3. DNA 鏈的合成： DNA 聚合酶 (如 Pol β) 識別這個缺口，並以模板鏈為基礎，合成新的鹼基，填補缺口。
4. DNA 鏈的連接： DNA 連接酶 (DNA ligase) 催化磷酸二酯鍵的形成，將新合成的 DNA 片段與鄰近的 DNA 連接起來，完成修復。

BER 的兩種模式：

• 短鏈 BER (Short-patch BER)： 通常由 Pol β 進行單個核苷酸的替換。
• 長鏈 BER (Long-patch BER)： 當受損鹼基周圍有多個核苷酸受損時，可能涉及更長的 DNA 片段的合成和替換，通常由 Pol δ 或 Pol ε 參與。

(b) 核苷酸切除修復 (Nucleotide Excision Repair, NER)：

NER 主要用於修復較大的 DNA 損傷，這些損傷會引起 DNA 結構的扭曲，例如由紫外線 (UV) 引起的嘧啶二聚體 (pyrimidine dimers) 或由化學物質引起的 DNA 加合物 (adducts)。

1. 識別損傷： NER 系統會識別 DNA 結構上的異常，例如由 UV 引起的嘧啶二聚體。在真核生物中，NER 的識別過程非常複雜，涉及多種蛋白質，包括 XPC-HR23B-Centrin 複合體，以及由 TFIIH 複合物中的解旋酶 (XPB 和 XPD) 負責的 DNA 解旋。

好的，這是一題關於小分子 RNA 的經典題型，主要在考察你對 siRNA (small interfering RNA) 和 miRNA (microRNA) 這兩種在基因調控中扮演重要角色的分子，在結構、生成途徑、功能以及作用機制上的異同。

解題過程

核心觀念：
siRNA 和 miRNA 都是長度約 20-25 個核苷酸的小分子 RNA，它們都參與 RNA 干擾 (RNA interference, RNAi) 途徑，透過與目標 mRNA 結合來調控基因表現。然而，它們的來源、生成機制、在細胞內的起始物以及主要調控的目標有所不同。

相似之處：

1. **分子大小與結構：**兩者都是雙鏈 RNA (dsRNA) 經過 Dicer 酶切割後產生的約 21-23 個核苷酸的單鏈 RNA 分子。它們都帶有 5' 磷酸基團和 3' 羥基基團，並且通常在 3' 端帶有兩個額外的核苷酸（稱為 overhang）。
2. **作用機制：**兩者都與 RISC (RNA-induced silencing complex) 結合，然後引導 RISC 辨識並結合到目標 mRNA 上。
3. **調控基因表現：**最終目的都是透過降解目標 mRNA 或抑制其轉譯來調控基因表現。
4. **參與 RNAi 途徑：**兩者都是 RNAi 途徑中的關鍵分子。

不同之處：

1. 來源與起始物：

   • siRNA： 主要來自外源性的雙鏈 RNA (dsRNA)，例如病毒 RNA 或實驗室導入的 dsRNA。在植物和一些無脊椎動物中，內源性的長鏈髮夾狀 RNA (hairpin RNA) 也可以被切割產生 siRNA。
   • miRNA： 主要來自內源性的基因轉錄產物。這些基因轉錄出的初級轉錄物 (pri-miRNA) 經過一系列加工，包括在細胞核內由 Drosha 複合物切割成前驅體 miRNA (pre-miRNA)，然後輸出到細胞質，再由 Dicer 切割成成熟的 miRNA。miRNA 的起始物通常是單鏈 RNA，但會形成髮夾結構。

2. 生成途徑的細節：

   • siRNA： 外源性 dsRNA 在細胞質中直接被 Dicer 切割成 siRNA。
   • miRNA： 內源性基因轉錄成 pri-miRNA (在細胞核) → Drosha 切割成 pre-miRNA → 輸出到細胞質 → Dicer 切割成 miRNA 前驅體 (miRNA/miRNA* duplex) → 其中一個鏈（成熟 miRNA）被選擇性地整合到 RISC 中，另一個鏈（miRNA*）則被降解。

3. 目標辨識與作用：

   • siRNA： 由於其來源通常是與目標 mRNA 序列高度同源的 dsRNA，因此 siRNA 在 RISC 中通常會與目標 mRNA 進行完全互補的配對。