115 年 國立成功大學微生物及免疫學研究所甲組《分子生物學》

本題主要考查細菌基因組中預測蛋白質編碼區（Open Reading Frame, ORF）的依據，以及如何預測其結構與功能。

(1) 預測蛋白質編碼區的序列特徵：
在細菌基因組中，一個 DNA 序列若可能被轉譯成蛋白質，通常會具備以下幾個關鍵的序列特徵：

• 起始密碼子 (Start Codon)： 大部分細菌的起始密碼子是 AUG，但也有 GUG、UUG 等。起始密碼子標誌著蛋白質合成的開始。
• 終止密碼子 (Stop Codon)： 序列的末端必須接續一個終止密碼子，如 UAA、UAG、UGA。這些密碼子標誌著蛋白質合成的結束。
• 開放閱讀框 (Open Reading Frame, ORF)： 從起始密碼子到終止密碼子之間，連續的核苷酸序列必須是三個的倍數（因為密碼子是三個核苷酸一組），且在起始密碼子之前和終止密碼子之後，不能有會干擾讀碼的終止密碼子。一個長的 ORF 是蛋白質編碼基因的重要指標。
• 核糖體結合位點 (Ribosome Binding Site, RBS) / Shine-Dalgarno 序列： 在起始密碼子（通常是 AUG）的上游，細菌mRNA上通常存在一個富含嘧啶的短序列，稱為 Shine-Dalgarno 序列（例如 GGAGG）。這個序列能與 16S rRNA 的特定序列互補配對，引導核糖體準確結合到 mRNA 上並開始轉譯。這個序列的存在與否及其與起始密碼子的距離，是預測轉譯效率的重要依據。
• GC 含量與密碼子使用偏好性 (Codon Usage Bias)： 不同物種的基因組具有不同的 GC 含量，蛋白質編碼基因的 GC 含量也可能與非編碼區有所不同。此外，生物體會偏好使用某些密碼子來編碼相同的胺基酸，這種密碼子使用偏好性也可以作為預測的參考。

【答案】開放閱讀框 (ORF) 的長度、起始密碼子 (AUG, GUG, UUG 等) 的存在、終止密碼子 (UAA, UAG, UGA) 的存在、核糖體結合位點 (Shine-Dalgarno 序列) 的存在及其與起始密碼子的距離。

(2) 預測蛋白質結構與功能的蛋白質方法：
一旦識別出一個潛在的蛋白質編碼序列，我們需要預測其結構與功能。這可以透過以下幾種方法：

本題主要考查兩種用於降低細胞內特定基因 RNA 表達量的分子生物學方法。這些方法通常透過干擾轉錄或轉譯過程來實現。

方法一：RNA 干擾 (RNA Interference, RNAi)

RNAi 是一種由雙鏈 RNA (dsRNA) 引發的、高度保守的基因沉默機制。在細胞中，可以透過外源導入 dsRNA 或利用 shRNA (short hairpin RNA) 來誘導。

• 過程簡述：
  1. dsRNA 導入與 Dicer 酶切割： 當細胞內存在 dsRNA（可以是外源導入的 siRNA 或由 shRNA 處理後產生的 dsRNA）時，一種核酸酶 Dicer 會識別並將長 dsRNA 切割成約 21-25 個核苷酸對的短 dsRNA，稱為小干擾 RNA (siRNA)。
  2. RISC 複合體形成與 siRNA 載入： siRNA 的一個股（通常是反義鏈）會與一系列蛋白質組成的 RNA 誘導的沉默複合體 (RNA-induced silencing complex, RISC) 結合。其中最重要的組分是 Argonaute (Ago) 蛋白質。
  3. 靶向 mRNA 並降解： RISC 複合體中的 siRNA 反義鏈會與細胞內與之具有序列互補性的目標 mRNA 分子結合。這種結合會激活 RISC 複合體中的核酸酶活性（通常由 Argonaute 蛋白質執行），進而切割並降解目標 mRNA。
  4. 結果： 目標 mRNA 的快速降解導致其翻譯成蛋白質的模板減少，進而降低了特定基因的蛋白質產量，達到降低 RNA 表達量的目的。

本題主要考查真核生物中 DNA 同源重組發生的時機，以及同源重組 (Homologous Recombination, HR) 與非同源末端連接 (Non-Homologous End Joining, NHEJ) 這兩種 DNA 修復途徑的主要區別。

(1) DNA 同源重組 (HR) 可能發生的時機：
在真核生物中，DNA 同源重組主要發生在細胞週期的特定階段，尤其是在 DNA 複製完成後，並且需要同源染色體或姐妹染色單體的存在。

• 減數分裂 (Meiosis)：

  • 減數第一次分裂前期 (Prophase I)： 這是 HR 最活躍的時期之一。在這個階段，同源染色體配對（synapsis），並形成交叉（chiasma）。交叉是同源染色體之間發生 DNA 交換的物理表現，即是同源重組的結果。這對於確保染色體的正確分離和增加遺傳多樣性至關重要。
  • 減數第二次分裂 (Meiosis II)： 雖然較少見，但在某些情況下，姐妹染色單體之間也可能發生有限的重組，尤其是在減數第二次分裂的後期，姐妹染色單體分離之前，如果 DNA 複製過程中發生了錯誤，可能觸發修復。

• 有絲分裂 (Mitosis)：

  • DNA 複製後 (S 期和 G2 期)： 在細胞週期的 S 期，DNA 進行複製，產生姐妹染色單體。在 S 期和 G2 期，HR 可以作為一種重要的 DNA 修復機制，用來修復複製叉崩潰（replication fork collapse）或雙鏈斷裂（Double-Strand Break, DSB）。此時，HR 通常利用姐妹染色單體作為模板進行修復，從而避免引入突變。

【答案】減數分裂前期 I (Prophase I) 的同源染色體配對與交叉，以及有絲分裂 S 期和 G2 期（DNA 複製後）作為雙鏈斷裂修復途徑。

(2) 同源重組 (HR) 與非同源末端連接 (NHEJ) 的區別：
HR 和 NHEJ 是真核細胞中兩種主要的 DNA 雙鏈斷裂修復途徑，它們在機制、時機、準確性及所需的模板方面有顯著差異。

| 特徵 | 同源重組 (Homologous Recombination, HR) | 非同源末端連接 (Non-Homologous End Joining, NHEJ) |

本題考查影響蛋白質產量（yield）下降的 DNA 突變可能造成的兩種機制。重點在於「產量下降」而非「完全不產生」。

機制一：影響 mRNA 的穩定性或轉譯效率

某些 DNA 突變雖然不直接導致蛋白質序列的巨大改變或過早終止，但可能影響轉錄後（post-transcriptional）或轉譯（translational）過程，從而降低最終蛋白質的產量。

• 影響 mRNA 穩定性：
  • 突變點位於 mRNA 的非編碼區 (UTR)： 位於 5' UTR 或 3' UTR 的突變可能影響 mRNA 與調控蛋白的結合，或影響 microRNA (miRNA) 的結合位點，導致 mRNA 被更頻繁地降解，從而減少可供翻譯的 mRNA 量。
  • 突變影響剪接 (Splicing)： 位於內含子-外顯子連接處（splice site）的突變，可能導致不完全或錯誤的剪接。雖然可能不會產生無意義的終止密碼子，但可能產生一種效率較低的剪接變體，或導致 mRNA 的不穩定。
• 影響轉譯效率：
  • 突變影響 5' UTR 的結構或起始密碼子附近序列： 5' UTR 中的結構或序列（如與核糖體結合的序列，或內含子在 5' UTR 中）會影響核糖體結合的效率和起始轉譯的效率。突變可能使這些區域發生改變，降低核糖體結合或起始轉譯的頻率。
  • 突變影響密碼子使用偏好性 (Codon Usage Bias)： 如果突變導致基因序列中出現較少使用的密碼子（rare codons），而細胞內攜帶這些稀有密碼子對應 tRNA 的豐度較低，則轉譯過程會變慢，核糖體可能在這些區域停滯，從而降低整體蛋白質的合成速率和產量。

本題為簡答題，包含三個獨立的小問題，分別考查 RNA 剪接、cDNA 的定義與生成、以及非編碼 RNA 的種類。

(1) RNA 剪接 (RNA Splicing) 的定義與可能造成的生物學現象：

• 定義： RNA 剪接是真核生物 mRNA 前驅體 (pre-mRNA) 在轉錄後進行的一種加工修飾過程。在此過程中，pre-mRNA 中的內含子 (introns) 會被準確地移除，而外顯子 (exons) 則會被連接起來，形成成熟的 mRNA 分子，然後才能出核參與轉譯。這個過程由剪接體 (spliceosome) 完成，剪接體是由小核核糖核蛋白 (snRNPs) 和其他蛋白質組成的複雜結構。

• 可能造成的生物學現象：

  • 外顯子合併 (Exon Shuffling)： 雖然剪接是移除內含子，但「外顯子合併」這個詞常被用來描述基因重組過程中，不同基因的外顯子可以被組合在一起，形成新的蛋白質，這與 RNA 剪接在外顯子組合方面的概念類似。
  • 備擇剪接 (Alternative Splicing)： 這是 RNA 剪接最重要也最廣泛的生物學現象。同一個 pre-mRNA 分子，可以透過不同的剪接方式，選擇性地包含或排除某些外顯子，或者選擇不同的剪接位點。這使得一個基因可以產生多種不同的 mRNA 分子，進而編碼多種結構和功能可能不同的蛋白質異構體 (protein isoforms)。備擇剪接極大地擴展了基因組編碼蛋白質的能力，是真核生物複雜性的重要來源。
  • 內含子滯留 (Intron Retention)： 在某些情況下，內含子可能未能被完全移除，而是被保留在成熟的 mRNA 中。這可能導致 mRNA 的讀碼框移位 (frameshift) 或產生無意義的終止密碼子，進而產生無功能或有毒的蛋白質。
  • 核苷酸序列的改變： 剪接過程中的錯誤（如剪接位點突變）可能導致外顯子被錯誤地保留或丟失，從而改變最終蛋白質的胺基酸序列，可能導致疾病。

【答案】RNA 剪接是真核生物 pre-mRNA 去除內含子、連接外顯子的過程。它可能導致備擇剪接（產生多種蛋白質異構體）、內含子滯留、或因剪接錯誤導致蛋白質序列改變。

(2) cDNA (Complementary DNA) 的定義與產生方式：

• 定義： cDNA (complementary DNA) 是指一種人工合成的 DNA 分子，它與某個 RNA 分子（通常是 mRNA）具有互補的序列。cDNA 是以 RNA 為模板，通過逆轉錄酶 (reverse transcriptase) 合成的。

• 產生方式：

  1. 分離目標 RNA： 首先，從細胞或組織中分離出總 RNA，然後可以通過選擇性地富集 mRNA（例如利用 poly(A) 尾巴的特性）來獲得目標 mRNA。
  2. 逆轉錄反應： 將分離出的 mRNA 與逆轉錄酶、dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) 和適當的引物 (primer) 混合。