112 年 國立成功大學微生物及免疫學研究所甲組《分子生物學》

此題為分子生物學的基礎概念題，要求考生定義、解釋或闡述十個重要的分子生物學術語。

(1) Real-time PCR (即時定量 PCR)：
是一種PCR技術，可以在聚合酶鏈式反應（PCR）的過程中，實時監測DNA擴增產物的量。透過螢光訊號的偵測，可以定量起始模板DNA的量。其原理是利用螢光染料（如SYBR Green）或螢光標記的探針（如TaqMan探針）與PCR產物結合，隨著PCR產物的增加，螢光訊號也隨之增強。
【答案】即時定量 PCR，一種在 PCR 過程中同步偵測螢光訊號以定量 DNA 擴增產物的技術。

(2) Reverse transcription (反轉錄)：
是指以RNA為模板，合成DNA的過程。這個過程由反轉錄酶（Reverse Transcriptase）催化，常見於RNA病毒（如HIV）的複製過程中，將其RNA基因組反轉錄為DNA，然後整合到宿主細胞的基因組中。在分子生物學實驗中，反轉錄常用於將mRNA轉錄為cDNA，以便進行後續的分析（如PCR、基因表現分析）。
【答案】以 RNA 為模板合成 DNA 的過程，由反轉錄酶催化，常見於 RNA 病毒複製及實驗室中將 mRNA 製成 cDNA。

(3) Monocistronic mRNA (單順位子 mRNA)：
是指一個mRNA分子僅包含一個基因的編碼序列，因此在轉譯時，只能產生一種蛋白質。這種mRNA在真核生物中非常普遍。與之相對的是多順位子 mRNA（polycistronic mRNA），一個mRNA分子包含多個基因的編碼序列，可以在轉譯時產生多種蛋白質，常見於原核生物。
【答案】一種 mRNA 分子僅編碼一種蛋白質的轉錄產物，在真核生物中常見。

(4) RNA interference (RNA干擾，RNAi)：
是一種調控基因表現的機制，透過雙股RNA（dsRNA）分子來抑制特定基因的表現。dsRNA會被Dicer酶切割成小分子干擾RNA（siRNA）或微小RNA（miRNA），然後與RNA誘導沉默複合體（RISC）結合，引導RISC辨識並降解目標mRNA，或抑制其轉譯，從而達到基因沉默的效果。
【答案】一種透過雙股 RNA 分子抑制基因表現的機制，利用 Dicer 和 RISC 複合體降解或抑制目標 mRNA 的轉譯。

(5) Promoter (啟動子)：
是位於基因起始點上游的一段DNA序列，是RNA聚合酶結合並啟動基因轉錄的位點。

此題考查 DNA 複製方向性的原因。

DNA 複製是半不連續的過程，主要原因是 DNA 聚合酶（DNA polymerase）的活性。DNA 聚合酶只能在現有 DNA 鏈的 3'-OH 末端添加新的核苷酸，也就是說，DNA 的合成方向永遠是 5' → 3'。

在複製叉處，兩條母鏈的解旋方向是相同的，但它們的走向是反向的（一條是 5'→3'，另一條是 3'→5'）。

• 前導股 (Leading strand)：這條母鏈的走向與複製叉的解旋方向一致（5'→3'）。DNA 聚合酶可以連續不斷地沿著這個方向合成新的 DNA 鏈，因此是 5'→3' 的合成。
• 延遲股 (Lagging strand)：這條母鏈的走向與複製叉的解旋方向相反（3'→5'）。

此題考查真核生物基因調控的四個層次。真核生物的基因調控是一個複雜且多步驟的過程，發生在細胞週期的不同階段和不同的細胞器中。以下是基因調控的四個主要層次：

1. 轉錄前調控 (Transcriptional control)：
   這是最常見也最主要的基因調控方式。透過調控 RNA 聚合酶能否結合啟動子，以及轉錄起始的頻率，來決定基因是否被轉錄以及轉錄的量。調控因子包括啟動子（promoter）、增強子（enhancer）、沉默子（silencer）以及各種轉錄因子（transcription factors）。這些因子與 DNA 結合，影響染色質結構或直接與 RNA 聚合酶複合體互動，進而控制轉錄的起始。

2. 轉錄後調控 (Post-transcriptional control)：
   在 RNA 合成後，但蛋白質轉譯前進行的調控。這包括：

   • RNA 剪接 (RNA splicing)：透過選擇性剪接（alternative splicing），一個基因可以產生多種不同的 mRNA，進而產生多種蛋白質。
   • mRNA 的穩定性與降解：mRNA 的壽命影響其被轉譯的機會。miRNA 和 siRNA 等小 RNA 分子可以透過與 mRNA 結合，促進其降解或抑制其轉譯。
   • mRNA 的運輸：mRNA 需要從細胞核運輸到細胞質才能進行轉譯。這個運輸過程也可以被調控。

此題考查如何運用 mRNA 技術於癌症治療。mRNA 疫苗技術在傳染病預防上已取得巨大成功，其原理是將編碼特定抗原的 mRNA 送入人體細胞，讓細胞自行製造抗原，進而誘導免疫反應。將此技術應用於癌症治療，策略上可以朝以下幾個方向發展：

核心策略：誘導病人自身免疫系統識別並攻擊癌細胞

癌症治療中的 mRNA 疫苗，主要目標是利用 mRNA 載體，讓病人的細胞產生癌細胞特有的抗原，進而引發針對這些癌細胞的免疫反應。

具體策略與步驟：

1. 識別和選擇癌細胞抗原 (Tumor-Associated Antigens, TAAs)：

   • 腫瘤特異性抗原 (Tumor-Specific Antigens, TSAs)：這些抗原僅在癌細胞上表達，在正常細胞上不表達，是理想的靶點。例如，由基因突變產生的新抗原（neoantigens）。
   • 腫瘤相關抗原 (Tumor-Associated Antigens, TAAs)：這些抗原在癌細胞上過度表達，或在正常細胞上少量表達。雖然可能引起一些脫靶效應，但仍是重要的靶點。
   • 策略：透過對病人的腫瘤樣本進行基因組學和蛋白質組學分析，找出病人特有的 TSA 和高表達的 TAA。特別是新抗原，它們是病人自身突變產生的，免疫系統更容易識別並產生強烈反應。

2. 設計和生產 mRNA 疫苗：

   • mRNA 設計：
     • 編碼序列：將選定的 TSA 或 TAA 的編碼序列設計成 mRNA。為了提高蛋白質的穩定性和表現量，可以對序列進行優化，例如使用優化的密碼子（codon optimization）、加入 5' 和 3' 非轉譯區（UTRs），以及 Poly(A) 尾。
     • 修飾核苷酸：使用修飾核苷酸（如假尿嘧啶，pseudouridine）來降低 mRNA 的免疫原性，延長其在細胞內的半衰期，並提高蛋白質的表現。
   • mRNA 生產：在體外進行轉錄（in vitro transcription, IVT）合成 mRNA。

3. mRNA 的遞送系統 (Delivery System)：

   • 脂質奈米顆粒 (Lipid Nanoparticles, LNPs)：這是目前最主流的 mRNA 遞送方式。LNPs 能夠保護 mRNA 免受核酸酶的降解，並幫助 mRNA 進入細胞。
   • 其他遞送系統：例如聚合物奈米顆粒、外泌體（exosomes）等，仍在研究中。

此題考查細胞自噬（autophagy）過程中線粒體（mitochondrion）的破壞機制。線粒體自噬（mitophagy）是自噬的一種特異性形式，專門清除受損或功能失調的線粒體，以維持細胞的健康和穩態。此過程涉及多個步驟和蛋白質複合物。

線粒體自噬的關鍵步驟：

1. 線粒體損傷的識別與信號傳導 (Mitochondrial Damage Recognition and Signaling)：

   • 當線粒體受到氧化壓力、ROS 過度產生、膜電位下降或蛋白質聚集等損傷時，會觸發線粒體自噬信號。
   • PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1) 和 Parkin (E3 ubiquitin ligase) 是線粒體自噬的核心調控因子。
   • 正常情況下，PINK1 在線粒體外膜表達，但會被持續轉運到線粒體內部並被降解。
   • 當線粒體損傷導致其膜電位下降時，PINK1 的轉運受阻，PINK1 會在線粒體外膜積累。

2. Parkin 的招募與線粒體泛素化 (Parkin Recruitment and Mitochondrial Ubiquitination)：

   • 積累在線粒體外膜上的 PINK1 會磷酸化多個下游底物，包括 Parkin 和外膜蛋白 Mitofusin 1/2 (Mfn1/2)。
   • 磷酸化後的 Parkin 會被招募到受損線粒體的外膜上。
   • 一旦被招募，Parkin 作為一個 E3 泛素連接酶，開始對線粒體外膜蛋白進行泛素化修飾。
   • Parkin 會催化形成多種泛素鏈，包括 K48 連接的泛素鏈（通常指向蛋白酶體降解）和 K63 連接的泛素鏈（參與信號傳導和自噬）。線粒體自噬主要依賴 K63 連接的泛素鏈。

3. 泛素鏈作為招募信號 (Ubiquitin Chains as Recruitment Signals)：

   • 線粒體外膜上的泛素鏈被能夠結合泛素的蛋白質（泛素結合域，ubiquitin-binding domains, UBDs）識別。
   • 這些蛋白質包括 p62/SQSTM1、NDP52 和 OPTN 等。它們同時也具有自噬體的膜結合結構域。