113 年 國立成功大學生理學研究所《細胞生物學》

此題主要考查細胞內脂質代謝相關的胞器：平滑內質網 (smooth ER) 和脂滴 (lipid droplets) 的結構特徵及其在維持細胞內脂質恆定中的功能。

題核心觀念： 胞器結構與功能、細胞內脂質代謝。

解題思路：
首先，需要分別描述平滑內質網和脂滴的結構特徵。接著，再闡述它們各自在調節細胞內脂質合成、儲存、運輸和代謝中所扮演的角色。

(1) 平滑內質網 (Smooth ER) 與脂滴 (Lipid Droplets) 的特徵：

• 平滑內質網 (Smooth ER)：

  • 結構： 是一個由膜連接的管狀結構網絡，與粗糙內質網 (rough ER) 相連，但缺乏附著的核糖體。其膜系統在細胞內形成連續的腔室。
  • 組成： 富含多種參與脂質代謝的酵素，如磷脂酶、膽固醇合成酶、類固醇激素合成酶等。
  • 動態性： 結構具有高度動態性，可以根據細胞的代謝需求進行形態和數量的調整。

• 脂滴 (Lipid Droplets)：

  • 結構： 是細胞質中單層膜包裹的球狀結構，其核心由疏水性的脂質（主要是三酸甘油酯 (triglycerides) 和膽固醇酯 (cholesteryl esters)）組成，外層是一層薄的磷脂雙層，並附著有專門的脂滴相關蛋白質 (PATs, SEIPINs 等)。
  • 形成： 通常形成於平滑內質網的膜上，並從中出芽。
  • 功能性： 是一種高度動態的細胞器，可以與多種細胞器（如 ER, mitochondria, lysosomes）相互作用，參與能量儲存、脂質訊號傳導、蛋白質降解等。

此題考查細胞能量代謝的核心胞器及其 ATP 生產機制。

題核心觀念： 能量代謝、細胞呼吸、胞器功能。

解題思路：
首先，需要辨識出細胞中負責能量產生的主要胞器。接著，針對這些胞器，闡述它們如何將食物中的營養物質轉化為細胞可利用的能量形式—ATP。

(1) 負責能量產生的胞器：

在真核細胞中，主要負責能量產生（ATP 合成）的胞器是：

• 粒線體 (Mitochondria)： 這是細胞進行有氧呼吸的主要場所，產生的 ATP 量最多。
• 細胞質 (Cytoplasm)： 進行糖解作用 (glycolysis)，這是 ATP 生成的第一步，發生在細胞質中，不需氧氣。

雖然葉綠體 (chloroplasts) 在植物細胞和藻類中也進行能量轉換（光合作用），但題目通常在討論動物細胞或一般真核細胞時，主要指粒線體。若題目是針對植物細胞，則葉綠體也應包含在內。由於題目未特別指明，我們將主要聚焦於粒線體和細胞質。

(2) 這些胞器如何產生 ATP：

• 糖解作用 (Glycolysis) - 發生於細胞質：

  • 過程： 一個葡萄糖分子（6 個碳）被分解成兩個丙酮酸分子（各 3 個碳）。
  • 產物： 淨產生 2 個 ATP 分子（透過底物層級磷酸化，substrate-level phosphorylation）和 2 個 NADH 分子（還原型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸）。
  • 條件： 這是無氧過程，可以在有氧或無氧條件下發生。

• 粒線體 (Mitochondria) - 進行有氧呼吸：

  • 丙酮酸氧化與檸檬酸循環 (Pyruvate Oxidation and Citric Acid Cycle)：
    • 丙酮酸進入粒線體基質 (mitochondrial matrix)。
    • 在基質中，丙酮酸被轉化為乙醯輔酶A (acetyl-CoA)，同時產生 NADH 和二氧化碳。

此題考查細胞分泌物質到細胞外循環系統的機制，主要涉及分泌途徑 (secretory pathways)。

題核心觀念： 細胞分泌、胞器運輸、膜融合。

解題思路：
分泌途徑是一個複雜的過程，涉及多個胞器協同作用。需要按照物質從細胞內合成到最終分泌出細胞的順序，描述各個環節的機制。

分泌途徑的機制：

細胞分泌胞內物質（如蛋白質、激素、神經傳導物質等）通常遵循一個稱為分泌途徑 (Secretory Pathway) 的過程，主要包括以下幾個步驟和關鍵胞器：

1. 合成與摺疊 (Synthesis and Folding)：

   • 場所： 大多數可溶性分泌蛋白和膜蛋白在附著於內質網 (Endoplasmic Reticulum, ER) 的核糖體上合成。
   • 機制： 隨著胜肽鏈的合成，它會被送入內質網腔 (ER lumen)。在內質網腔內，蛋白質會進行摺疊，形成正確的三維結構，並可能進行初步的修飾，如醣基化 (glycosylation)。伴侶蛋白 (chaperone proteins) 在此過程中協助蛋白質正確摺疊。

2. 轉運到高爾基體 (Transport to the Golgi Apparatus)：

   • 機制： 摺疊正確的蛋白質會從內質網運輸到高爾基體 (Golgi apparatus)。這種運輸通常通過形成小囊泡 (vesicles) 進行，這些囊泡從內質網的特定區域（如 ER exit sites, ERES）出芽，然後與高爾基體的順面 (cis-Golgi network, CGN) 融合。

3. 高爾基體內的修飾與分選 (Modification and Sorting in the Golgi)：

此題緊接上一題，考查細胞如何將細胞外的物質攝入細胞內，即內吞作用 (endocytosis)。

題核心觀念： 內吞作用、胞吞、受體介導內吞、胞飲。

解題思路：
內吞作用是細胞攝取細胞外物質的重要方式。需要描述不同類型的內吞作用及其發生的機制。

內吞作用的機制：

內吞作用是細胞通過改變細胞膜形態，將細胞外物質包裹並形成囊泡，然後將囊泡送入細胞質的過程。主要有以下幾種類型：

1. 吞噬作用 (Phagocytosis)：

   • 特點： 「細胞吃」，細胞吞入較大的顆粒狀物質，如細菌、病毒、細胞碎片等。
   • 機制：
     • 識別與結合： 吞噬細胞（如巨噬細胞、中性粒細胞）表面的受體識別並結合細胞外的大顆粒物質。
     • 偽足形成： 結合後，細胞膜向外延伸形成偽足 (pseudopods)，包裹住目標物質。
     • 囊泡形成： 偽足癒合，將物質完全包裹形成一個大的內吞囊泡，稱為吞噬體 (phagosome)。
     • 與溶酶體融合： 吞噬體隨後會與溶酶體 (lysosome) 融合，溶酶體內的酶會降解吞噬體內的物質。
   • 功能： 主要參與免疫防禦、清除死亡細胞和異物。

2. 胞飲作用 (Pinocytosis)：

   • 特點： 「細胞喝」，細胞吞入小分子溶質和細胞外液。
   • 機制：
     • 膜內陷： 細胞膜表面發生無選擇性的內陷，形成小囊泡。
     • 囊泡形成： 內陷的膜閉合，形成小的內吞囊泡（胞飲小泡，pinocytotic vesicles），其中包含被捕獲的細胞外液和溶質。
     • 與溶酶體融合： 這些小泡隨後進入細胞質，並可能與溶酶體融合，釋放其中的物質。
   • 功能： 參與吸收細胞外液體和溶質，維持細胞內外離子和營養物質的平衡。

此題考查對 mRNA 疫苗原理及其在人體內作用機制的理解。

題核心觀念： mRNA 疫苗、蛋白質合成、免疫反應。

解題思路：
首先，要理解 mRNA 疫苗的核心設計理念，即如何利用 mRNA 分子來引導人體細胞產生抗原。接著，要闡述這些產生的抗原如何觸發人體的免疫系統，從而達到保護作用。

(1) 設計 COVID-19 mRNA 疫苗的概念：

COVID-19 mRNA 疫苗的設計概念是利用信使 RNA (messenger RNA, mRNA) 分子，將 SARS-CoV-2 病毒的特定抗原（通常是棘狀蛋白，Spike protein）的遺傳密碼傳遞給人體細胞。其核心理念可以概括為：

• 載體 (Carrier)： mRNA 分子本身作為遺傳信息的載體。
• 指令 (Instruction)： mRNA 分子攜帶製造病毒棘狀蛋白的「指令」。棘狀蛋白是 SARS-CoV-2 病毒用來入侵人體細胞的關鍵蛋白質，也是人體免疫系統最容易識別的目標抗原。
• 細胞工廠 (Cellular Factory)： 將 mRNA 遞送到人體細胞（通常是肌肉細胞或免疫細胞）中。這些細胞的核糖體會將 mRNA 上的指令「翻譯」成棘狀蛋白。
• 抗原呈現 (Antigen Presentation)： 人體細胞合成的棘狀蛋白會被呈現到細胞表面，或者被細胞內的免疫系統識別，進而引發免疫反應。
• 非整合性 (Non-integrating)： mRNA 分子不會整合到人體細胞的 DNA 中，其遺傳信息在一段時間後會自行降解，因此不會改變人體的基因組。

具體設計要點：

• mRNA 序列優化： mRNA 的序列經過優化，以提高其穩定性、翻譯效率和免疫原性。例如，將尿嘧啶 (U) 替換為假尿嘧啶 (pseudouridine, ψ) 可以提高穩定性和降低免疫原性。
• 5' 端帽和 3' 端多聚腺苷酸尾 (5' cap and 3' poly-A tail)： 這些結構模仿天然 mRNA，有助於核糖體識別和結合，提高翻譯效率，並保護 mRNA 免受核酸酶的降解。
• 脂質奈米顆粒 (Lipid Nanoparticles, LNPs)： mRNA 分子本身不穩定且難以穿透細胞膜，因此通常被包裹在脂質奈米顆粒中。LNPs 能夠保護 mRNA 免受降解，並幫助其進入細胞。

(2) COVID-19 mRNA 疫苗在人體內如何有效運作：

此題考查蛋白質合成過程及翻譯後修飾對蛋白質功能和命運的影響。

題核心觀念： 蛋白質合成、轉譯、翻譯後修飾、蛋白質降解、蛋白質定位。

解題思路：
首先，需要描述蛋白質從 mRNA 到多肽鏈的合成過程。接著，選擇一種對蛋白質命運（如定位、降解、活化/失活）有重要影響的翻譯後修飾進行詳細闡述。

(1) 蛋白質的合成 (Protein Synthesis)：

蛋白質的合成過程稱為轉譯 (Translation)，發生在細胞質的核糖體上，其模板是信使 RNA (mRNA)。

• 起始 (Initiation)：

  • 核糖體的小亞基 (small ribosomal subunit) 與 mRNA 的 5' 端結合，並尋找起始密碼子 (start codon)，通常是 AUG。
  • 攜帶第一個胺基酸（真核生物是甲硫胺酸，methionine）的起始 tRNA (initiator tRNA) 與起始密碼子結合。
  • 核糖體的大亞基 (large ribosomal subunit) 結合，形成完整的起始複合物。

• 延伸 (Elongation)：

  • 第二個胺基酸的 tRNA 進入核糖體 A 位點 (A site)，與 mRNA 的第二個密碼子配對。
  • 肽基轉移酶 (peptidyl transferase) 催化 A 位點的胺基酸與 P 位點 (P site) 上肽鏈的 C 端形成肽鍵。
  • 核糖體沿著 mRNA 移動一個密碼子（轉位，translocation），使肽鏈所在的 tRNA 從 P 位點移動到 E 位點 (E site)，然後脫離。新的 tRNA 進入 A 位點，重複延伸過程。
  • 此過程需要能量（GTP 水解）和延伸因子 (elongation factors) 的協助。

• 終止 (Termination)：

  • 當核糖體移動到 mRNA 上的終止密碼子 (stop codon, UAA, UAG, UGA) 時，沒有 tRNA 能與之配對。
  • 釋放因子 (release factors) 結合到 A 位點，觸發肽鍵水解，使新合成的多肽鏈從 P 位點的 tRNA 上脫落。
  • 核糖體亞基、mRNA 和 tRNA 分開，完成蛋白質合成。

簡化描述： 蛋白質合成起始於核糖體識別 mRNA 上的起始信號，然後按照 mRNA 的密碼順序，通過 tRNA 攜帶相應的胺基酸，逐一連接形成多肽鏈。當遇到終止信號時，合成結束，多肽鏈釋放。

(2) 決定蛋白質命運的一種翻譯後修飾：

此題為一個情境題，共包含三個子題，分別考查在不同實驗結果下的研究設計，涉及蛋白質定位、基因表達調控以及蛋白質降解途徑。

題核心觀念： 蛋白質定位、免疫螢光染色、Western Blot、RT-qPCR、mRNA 穩定性、泛素-蛋白酶體系統、自噬-溶酶體途徑。

---

(1) Scenario 1: 蛋白質定位實驗設計與重要性

核心目標： 確定細胞外刺激是否會引起 NCKU 蛋白在細胞內的亞細胞定位發生變化。

實驗設計：

1. 細胞培養： 選擇合適的細胞系，並在培養條件下進行處理。
2. 刺激處理： 將細胞分成兩組：
   • 對照組 (Control group)：不給予細胞外刺激。
   • 實驗組 (Experimental group)：給予特定的細胞外刺激（例如，某種生長因子、激素、或細胞因子）。
3. 蛋白質定位檢測方法 (選擇一種或組合)：
   • 免疫螢光染色 (Immunofluorescence Microscopy, IF)：
     • 步驟：
       • 將處理過的細胞固定在載玻片上。
       • 透化 (permeabilization) 細胞膜，使抗體能夠進入細胞內部。
       • 使用針對 NCKU 蛋白的特異性一級抗體 (primary antibody) 進行孵育。
       • 使用帶有螢光標記的二級抗體 (secondary antibody) 進行孵育，該二級抗體能識別並結合一級抗體。
       • 在螢光顯微鏡下觀察細胞，觀察 NCKU 蛋白的螢光信號在細胞內的分布情況。
       • 可以同時染色細胞器標記物（如 DAPI 染細胞核、 MitoTracker 染粒線體、ER-Tracker 染 ER 等），以精確確定 NCKU 蛋白的亞細胞定位。
     • 比較： 比較對照組和實驗組細胞中 NCKU 蛋白的螢光信號分布，判斷是否存在定位轉移。
   • 免疫電鏡 (Immunoelectron Microscopy, IEM)：
     • 步驟： 類似免疫螢光，但使用電子顯微鏡。通常使用金粒子標記的抗體，觀察 NCKU 蛋白在細胞超微結構中的確切位置。
     • 優點： 提供更高的空間分辨率，能精確到奈米級。
   • 細胞器分離與 Western Blot：
     • 步驟：
       • 分別分離細胞內的特定細胞器（如細胞核、細胞質、粒線體、內質網等）。
       • 對每個細胞器組分進行 Western Blot 分析，使用抗 NCKU 蛋白的抗體檢測是否存在 NCKU 蛋白。
       • 同時用細胞器標記蛋白作為陽性對照，驗證分離的純度。
     • 比較： 比較刺激前後，NCKU 蛋白在各細胞器組分中的豐度變化。

實驗的重要性：

• 驗證假說： 這是直接驗證「細胞外刺激引起 NCKU 蛋白亞細胞重分佈」這一假說的關鍵實驗。
• 功能闡釋： 蛋白質的亞細胞定位通常與其功能密切相關。如果 NCKU 蛋白從細胞質轉移到細胞核，可能意味著它參與轉錄調控；轉移到細胞膜可能參與信號傳導；轉移到粒線體可能與能量代謝有關。確定其定位可以為進一步研究其功能提供線索。
• 疾病機制理解： 如果 NCKU 蛋白的異常定位與某些疾病相關，則此實驗有助於理解疾病的發生機制。
• 藥物開發靶點： 確定蛋白質的定位和其在信號通路中的作用，有助於開發針對該蛋白質的靶向藥物。

【答案】(1) 實驗設計：細胞培養後，將細胞隨機分為對照組和實驗組，實驗組給予細胞外刺激。通過免疫螢光染色或免疫電鏡，使用特異性抗 NCKU 蛋白的抗體檢測刺激前後 NCKU 蛋白在細胞內的空間分布，並與細胞器標記物進行比較。或者，通過細胞器分離後進行 Western Blot 分析 NCKU 蛋白在各細胞器中的豐度變化。實驗重要性：直接驗證假說，闡釋 NCKU 蛋白的功能，並為理解其在細胞生理或病理過程中的作用提供關鍵依據。

---

(2) Scenario 2: 評估轉錄或轉譯調控的實驗設計

核心目標： 確定細胞外刺激降低 NCKU 蛋白表達水平是通過影響轉錄（mRNA 水平）還是轉譯（蛋白質合成）過程。

實驗設計：

1. 細胞培養與刺激： 與 Scenario 1 類似，將細胞分為對照組和實驗組，給予細胞外刺激。
2. 檢測 NCKU 蛋白水平：
   • Western Blot： 在刺激處理後，收取細胞樣品，進行 Western Blot 分析，確認 NCKU 蛋白水平確實顯著降低。這是實驗的前提。
3. 評估轉錄水平調控：
   • 定量逆轉錄 PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR, RT-qPCR)：
     • 步驟：
       • 從對照組和實驗組細胞中提取總 RNA (total RNA)。
       • 使用逆轉錄酶將 RNA 反轉錄為 cDNA (complementary DNA)。
       • 使用針對 NCKU 基因的特異性引物 (primers) 和內參基因（如 GAPDH, Actin）的引物，進行定量 PCR。
       • 比較實驗組和對照組細胞中 NCKU mRNA 的相對含量。
     • 結果判讀：
       • 如果 NCKU mRNA 水平也顯著降低，則表明刺激可能通過轉錄水平調控 NCKU 蛋白的表達（例如，抑制 NCKU 基因的轉錄）。
       • 如果 NCKU mRNA 水平沒有顯著變化，但蛋白質水平降低，則表明調控可能發生在轉譯後水平。
4. 評估轉譯水平調控 (或 mRNA 穩定性)：
   • mRNA 穩定性實驗 (Actinomycin D 或 DRB 處理)：
     • 步驟：
       • 首先，用細胞外刺激處理細胞一段時間，觀察到 NCKU 蛋白水平的下降。
       • 然後，在繼續刺激的同時，加入一種轉錄抑制劑（如 Actinomycin D 或 DRB），該抑制劑能阻止新的 RNA 合成，但不會影響已合成的 mRNA 的穩定性。
       • 在不同的時間點收取細胞樣品，進行 Western Blot 分析 NCKU 蛋白水平的變化。