113 年 國立成功大學環境醫學研究所乙組在職生《化學儀器分析》

本題考查化學儀器分析中，評估分析方法性能的六個重要數值指標，包含精密度(precision)、準確度(bias)、靈敏度(sensitivity)、偵測極限(detection limit)、動態範圍(dynamic range)及選擇性(selectivity)。考生需先解釋這些名詞的意義，再說明如何評估與計算。

一、六個數值指標的意義與評估方法

1. 精密度 (Precision)

   • 意義： 指同一分析方法在重複進行時，所測得結果彼此之間的接近程度。精密度越高，表示結果的變異性越小。它通常透過重複測量同一份樣品來評估。
   • 評估與計算：
     • 方法： 重複測量一個已知濃度或空白樣品多次 (例如 n 次)。
     • 計算：
       • 標準差 (Standard Deviation, $s$)： 衡量數據分散程度的最常用指標。
         $s = \sqrt{\frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}{n-1}}$
         其中 $x_i$ 為各次測量值，$\bar{x}$ 為平均值，n 為重複次數。
       • 相對標準差 (Relative Standard Deviation, RSD) 或 變異係數 (Coefficient of Variation, CV)： 以百分比表示，更方便比較不同量級的數據。
         $RSD\% = CV\% = \frac{s}{\bar{x}} \times 100\%$
     • ICPOES 應用： 對一份含砷的血液樣品重複測定，計算其含砷濃度的標準差或 RSD。

2. 準確度 (Bias)

   • 意義： 指測量結果與真實值 (真值) 之間的系統性差異。Bias 為正值表示測量值傾向於偏高，為負值表示傾向於偏低。它反映了分析方法的準確性。
   • 評估與計算：
     • 方法：
       • 測定標準物質 (Certified Reference Material, CRM)： 使用已知準確濃度的標準物質進行測定，將測量平均值與標準物質標示值比較。
       • 回收率實驗 (Recovery Study)： 在真實樣品中加入已知量的待測物 (加標)，然後測定樣品中總待測物的量，計算回收率。
     • 計算：
       • Bias (絕對值)：
         $Bias = \bar{x} - \text{True Value}$
         其中 $\bar{x}$ 為測量平均值，True Value 為真實值 (CRM 標示值或加標量)。
       • Bias (%)：
         $Bias\% = \frac{\bar{x} - \text{True Value}}{\text{True Value}} \times 100\%$
       • 回收率 (%)：
         $Recovery\% = \frac{\text{Measured Total Amount} - \text{Original Amount}}{\text{Spiked Amount}} \times 100\%$
         或
         $Recovery\% = \frac{\text{Measured Amount in Spiked Sample} - \text{Measured Amount in Unspiked Sample}}{\text{Spiked Amount}} \times 100\%$
     • ICPOES 應用： 使用含砷 CRM 血液樣品，或在無砷血液樣品中加入已知量的砷，測定回收率。

3. 靈敏度 (Sensitivity)

   • 意義： 指分析儀器或方法對待測物濃度變化的響應程度。高靈敏度意味著即使待測物濃度有微小變化，儀器也能產生明顯的訊號變化。它與儀器的斜率 (slope) 或校準曲線的斜率有關。
   • 評估與計算：
     • 方法： 繪製校準曲線 (訊號強度 vs. 濃度)。
     • 計算：
       • 校準曲線的斜率 (Slope)：
         $\text{Slope} = \frac{\Delta \text{Signal}}{\Delta \text{Concentration}}$
         斜率越大，靈敏度越高。
       • 分析靈敏度 (Analytical Sensitivity) 或 鑑別靈敏度 (Discrimination Sensitivity)： 指能區分兩個接近濃度樣品的能力。
     • ICPOES 應用： 測定一系列不同濃度砷的標準溶液，繪製校準曲線，計算其斜率。

4. 偵測極限 (Detection Limit, LOD)

   • 意義： 指分析方法能夠可靠地偵測到的最低待測物濃度。通常定義為訊號顯著區別於背景訊號的最低濃度。
   • 評估與計算：
     • 方法：
       • 基於訊號與雜訊比 (S/N Ratio)： 通常定義為 S/N = 3。
       • 基於空白樣品的標準差： 測定空白樣品多次，計算其訊號的標準差 ($s_{blank}$)，LOD 通常為 $3 \times s_{blank}$ (訊號值)，再轉換為濃度。
       • 基於校準曲線的標準偏差： 使用校準曲線的標準偏差 ($s_y$) 和斜率 (m)。
     • 計算 (常用公式)：
       • 基於 S/N：
         $LOD = \frac{3 \times \text{Noise Level}}{\text{Sensitivity (Slope)}}$
       • 基於空白標準差 (訊號值)：
         $LOD_{\text{signal}} = 3 \times s_{blank}$
         再將此訊號值轉換為濃度：
         $LOD_{\text{concentration}} = \frac{3 \times s_{blank}}{\text{Slope}}$
       • 基於校準曲線：
         $LOD = \frac{3 \times s_y}{m}$
         其中 $s_y$ 是校準曲線的標準偏差，m 是校準曲線的斜率。
     • ICPOES 應用： 測定一系列空白血液樣品，計算其背景砷訊號的標準差，或計算校準曲線的 $s_y$ 和斜率，來估算砷的 LOD。

5. 動態範圍 (Dynamic Range)

   • 意義： 指分析方法能夠提供準確、精確測量結果的待測物濃度範圍。它由方法能偵測到的最低濃度 (通常與 LOD 相關) 到最高濃度 (訊號開始飽和或偏離線性關係的點) 所定義。
   • 評估與計算：
     • 方法： 繪製校準曲線，觀察訊號隨濃度變化的線性範圍。
     • 計算：
       • 線性範圍的下限： 通常是 LOD 或 LOQ (Quantitation Limit)。
       • 線性範圍的上限： 指訊號強度開始偏離線性關係的最高濃度點。

本題考查光譜學中三種重要現象：吸收(absorption)、螢光(fluorescence)和化學冷光(chemiluminescence)的原理，以及對應儀器的結構與操作。考生需繪製能量圖、方塊圖，並解釋其原理及差異。

一、能量圖 (Energy Diagrams)

1. 吸收 (Absorption)

   • 原理： 分子或原子吸收特定波長的光能，從基態 ($S_0$) 躍遷到激態 ($S_1, S_2, ...$ 或 $T_1, T_2, ...$)。吸收的光能是 $E = h\nu$。
   • 能量圖：
     • 基態 ($S_0$)。
     • 激態 ($S_1, S_2, ...$)，能量高於基態。
     • 當光照射時，電子從 $S_0$ 躍遷到某個激態 $S_n$。
     • 激態分子會快速地透過振動弛豫 (vibrational relaxation) 衰減到最低振動能階的同一電子態 (如 $S_1$)。
     • 吸收的光能被用於此電子躍遷。
   • 圖示：

     Energy
       ^
       |      S2 ----- Electronic Transition (Absorption)
       |      |
       |      S1 ----- Vibrational Relaxation
       |      |
       |      S0 (Ground State)
       +----------------->
     

2. 螢光 (Fluorescence)

   • 原理： 分子吸收光能躍遷到激態 ($S_1$) 後，再從激態的最低振動能階躍遷回基態 ($S_0$)，同時發出光。螢光是單重態到單重態的躍遷，通常非常快速 (10⁻⁹ - 10⁻⁷ s)。
   • 能量圖：
     • 包含吸收過程：基態 ($S_0$) 吸收光能躍遷到激態 ($S_1, S_2, ...$)。
     • 振動弛豫：激態分子衰減到 $S_1$ 的最低振動能階。
     • 螢光發射：從 $S_1$ 的最低振動能階躍遷回 $S_0$ 的不同振動能階，並發出螢光。因為螢光躍遷回 $S_0$ 的振動能階能量較低，所以螢光波長通常大於激發波長 (斯托克斯位移, Stokes Shift)。
   • 圖示：

     Energy
       ^
       |      S2 ----- Electronic Transition (Absorption)
       |      |
       |      S1 ----- Vibrational Relaxation
       |      |  \
       |      |   \  Fluorescence (Emission)
       |      |    \
       |      S0 -----
       +----------------->
     

3. 化學冷光 (Chemiluminescence)

   • 原理： 化學反應產生一個能量較高的活化中間產物，該產物在不發光的情況下直接躍遷到激發態，然後從激發態回到基態時發出光。此過程不需外部光源激發。
   • 能量圖：
     • 化學反應：反應物 A + B → 活化中間產物 (Excited State Intermediate)
     • 激態中間產物直接處於激發態 (如 $S_1^*$)。
     • 化學冷光發射：激態中間產物從 $S_1^*$ 躍遷回基態 ($S_0$)，發出光。
   • 圖示：

     Energy
       ^
       |      Excited State Intermediate (S1*) ----- Chemiluminescence Emission
       |      |
       |      Ground State Intermediate (S0)
       |
       |  Reactants (A+B) --- Chemical Reaction --->
       +----------------->
     

二、儀器方塊圖與操作原理

1. 吸收光譜儀 (Absorption Spectrometer)

   • 方塊圖：

     Light Source --> Wavelength Selector --> Sample Cell --> Detector --> Signal Processor --> Readout
     (e.g., Lamp)   (e.g., Monochromator) (Cuvette)       (e.g., Photodiode)
     

   • 組件與原理：
     • 光源 (Light Source)： 提供連續光譜 (如鎢燈、氘燈) 或特定波長的光。
     • 波長選擇器 (Wavelength Selector)： 如單色儀 (monochromator) 或濾光片，選擇單一或窄帶的波長照射樣品。
     • 樣品室 (Sample Cell)： 盛放樣品 (通常是液體，裝在比色皿 cuvette 中)。
     • 偵測器 (Detector)： 測量穿過樣品的透射光強度 (I)。常見有光電二極體 (photodiode)、光電倍增管 (PMT)。
     • 訊號處理器與讀出 (Signal Processor & Readout)： 計算吸光度 (Absorbance, A)，通常依據 Beer-Lambert 定律 $A = -\log(I/I_0)$，其中 $I_0$ 是空白樣品的透射光強度。
   • 操作： 光源發光，經波長選擇器選出特定波長，照射含有待測物的樣品。偵測器測量透射光強度，與未含樣品時的強度 (參考值) 比較，計算吸光度。

2. 螢光光譜儀 (Fluorescence Spectrometer)

   • 方塊圖：

本題考查液相層析法中，影響柱效的 van Deemter 方程式及其相關參數。考生需理解該方程式的物理意義，並闡述顆粒大小如何影響柱效與壓降。

一、Van Deemter 方程式與參數

Van Deemter 方程式描述了理論塔板高度 (Height Equivalent to a Theoretical Plate, HETP, 符號為 H) 與載體流速 (linear velocity of mobile phase, 符號為 u) 之間的關係。HETP 是衡量層析柱分離效率的指標，H 越小，表示分離效率越高。

Van Deemter 方程式：
$H = A + \frac{B}{u} + Cu$

其中：

• $H$：理論塔板高度 (cm)。
• $u$：流相線速度 (cm/s)。
• $A$：渦流擴散項 (Eddy diffusion term)，與多路徑效應有關。
• $B$：縱向分子擴散項 (Longitudinal molecular diffusion term)，與流相中分子擴散有關。
• $C$：傳質阻力項 (Mass transfer term)，與滯相和流相之間的傳質速率有關。

參數意義與影響：

1. A 渦流擴散項 (Eddy Diffusion Term)

   • 意義： 在填充柱中，固定相顆粒排列並非均一，流相在顆粒之間通過時會形成多條路徑，導致樣品分子在不同時間通過柱子。這是一個與流速 $u$ 無關的項，主要由填充柱的結構和顆粒的均一性決定。
   • 影響： A 越大，表示多路徑效應越嚴重，柱效越低。理想情況下，顆粒越小、填充越均一、圓柱形狀越規則，A 值越小。

2. B 縱向分子擴散項 (Longitudinal Molecular Diffusion Term)

   • 意義： 在流相中，樣品分子會自發地從高濃度區域擴散到低濃度區域 (縱向擴散)，即使在流相靜止時也會發生。此項與分子擴散係數 ( $D_m$ ) 成正比，與流速 $u$ 成反比。
   • 影響： B 越大，表示分子擴散越嚴重，柱效越低。此項在低流速時影響較大，因為分子有更多時間進行擴散。

3. C 傳質阻力項 (Mass Transfer Term)

   • 意義： 樣品分子在流相和固定相之間進行分配和轉移需要時間。如果傳質速率跟不上流速的變化，樣品分子會在流相和固定相之間產生滯後，導致峰形展寬。此項與流速 $u$ 成正比，代表了流相和固定相之間的傳質阻力。
   • 影響： C 越大，表示傳質阻力越大，峰展寬越嚴重，柱效越低。此項在高流速時影響較大。
     • $C_s$ (或 $C_f$)：固定相傳質阻力。
     • $C_m$ (或 $C_l$)：流相傳質阻力。
     • 在液相層析中，通常 $C_s$ 佔主導地位，與顆粒大小、固定相的孔隙率、流相的黏度等有關。

二、Van Deemter 曲線

將 $H$ 對 $u$ 作圖，會得到一個曲線。

• 在低流速 ($u$) 時，$B/u$ 項佔主導，H 隨 $u$ 增加而減小。
• 在高流速 ($u$) 時，$Cu$ 項佔主導，H 隨 $u$ 增加而增加。
• 存在一個最佳流速 ($u_{opt}$) ，在此流速下 H 達到最小值 ($H_{min}$)，此時層析柱的效率最高。
• $H_{min} = A + 2\sqrt{BC}$
• $u_{opt} = \sqrt{B/C}$

本題考查質譜儀操作中真空系統的重要性，以及三種常用高真空泵的工作原理。考生需要闡述真空度不足對質譜儀的影響，並詳細說明擴散泵、渦輪分子泵和低溫泵的原理。

一、真空度不足對質譜儀操作的影響

質譜儀 (Mass Spectrometer, MS) 的核心是離子在真空環境中傳輸和檢測。真空環境至關重要，其主要影響包括：

1. 離子碰撞頻率增加 (Increased Ion Collision Frequency)：

   • 在非真空環境下，離子在飛行管中會與殘餘氣體分子發生頻繁碰撞。
   • 影響：
     • 離子散射 (Ion Scattering)： 離子碰撞後改變運動方向，導致無法到達質譜儀的質量分析器或偵測器，降低訊號強度和靈敏度。
     • 離子碎裂 (Ion Fragmentation)： 碰撞可能導致待測離子發生碎裂，產生非目標離子，影響質譜圖的準確性。
     • 能量損失： 離子在碰撞中損失能量，影響其在質量分析器中的飛行時間或軌跡。

2. 樣品污染與背景訊號增加 (Sample Contamination and Increased Background Signal)：

   • 殘餘氣體 (如空氣、水蒸氣、溶劑蒸氣) 會與離子源中的樣品發生反應，或直接被引入質譜儀，增加背景訊號，降低訊噪比 (S/N ratio)。
   • 影響： 難以偵測到低濃度的目標分析物，尤其是在痕量分析中。

3. 離子源和質量分析器損壞 (Damage to Ion Source and Mass Analyzer)：

   • 高壓電場 (如在離子源或四極桿質量分析器中) 在有氣體分子存在時，可能引發電暈放電 (corona discharge) 或電弧 (arcing)，損壞昂貴的儀器組件。
   • 某些離子源 (如 ESI) 對氣體成分敏感，殘餘氣體可能影響液滴的形成和離子化效率。

4. 影響離子化效率 (Affects Ionization Efficiency)：

   • 某些離子化方法 (如 ESI, APCI) 的效率可能受氣體壓力影響。例如，在 ESI 中，過高的殘餘氣體壓力可能影響液滴的蒸發和電荷的轉移。

5. 影響真空泵壽命 (Affects Vacuum Pump Lifespan)：

   • 如果前級泵 (如機械泵) 或高真空泵在壓力過高的情況下長時間運行，會加速其損耗。

二、常用高真空泵的工作原理

質譜儀通常需要達到 10⁻⁵ Pa 至 10⁻⁸ Pa 的高真空或超高真空。常用的高真空泵有以下三種：

1. 擴散泵 (Diffusion Pump)
   • 原理： 屬於動量傳遞泵 (momentum transfer pump)。
   • 工作方式：
     • 泵底部有加熱裝置，使工作液 (通常是高真空的矽油或擬 PFO) 蒸發成蒸汽。
     • 蒸汽上升，通過特殊的噴嘴 (nozzle)。
     • 高速噴射的蒸汽分子與從泵口吸入的氣體分子碰撞，將氣體分子的動量傳遞給蒸汽，使氣體分子沿著泵的出口方向運動。
     • 蒸汽在泵的冷卻夾套 (由冷卻水循環) 上冷凝成液體，流回泵的底部，循環使用。
     • 氣體分子被推向機械泵 (前級泵) 以排出系統。

本題考查質譜學中兩種主要的離子化技術 (ESI, MALDI) 和兩種常見的質量分析器 (Quadrupole, Orbitrap) 的工作原理及應用。考生需要詳細闡述它們的機制和適用範圍。

一、離子化技術 (Ionization Techniques)

(A) ESI (Electrospray Ionization) 和 MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)

1. ESI (Electrospray Ionization, 電噴霧離子化)

   • 工作原理：
     • 溶液進樣： 將待測物溶解在極性溶劑中 (通常是水/有機溶劑混合物，如乙腈/水，含少量酸或鹼作為添加劑)。
     • 電噴霧： 將待測物溶液通過一個細長的毛細管，毛細管末端施加高電壓 (通常為 3-5 kV)。
     • 帶電液滴形成： 在高電壓作用下，溶液表面產生庫侖力，克服表面張力，形成帶電的微小液滴噴霧。
     • 溶劑蒸發與電荷積聚： 這些帶電液滴在電場作用下向質譜儀的入口移動，同時溶劑不斷蒸發。隨著溶劑的蒸發，液滴表面的電荷密度不斷增加，最終超過穩定性極限。
     • 離子釋放 (離子脫附)： 當液滴變得不穩定時，會發生「離子焦耳-湯姆遜效應」(ion-Coulomb explosion) 或「離子剝離」(ion evaporation) 等過程，將帶電的待測物分子 (或其加合物) 從液滴表面釋放出來，進入氣相。
     • 多價離子形成： ESI 能夠產生多價離子，這使得大分子 (如蛋白質) 能夠在較低的質量電荷比 (m/z) 範圍內被檢測，擴大了質譜儀的質量範圍。
   • 應用：
     • 生物大分子分析： 蛋白質、肽類、核酸、多醣等。
     • 藥物分析： 藥物及其代謝物的定性定量。
     • 環境分析： 污染物分析。
     • 液相層析-質譜聯用 (LC-MS)： ESI 作為 LC 的高效接口，非常普遍。
   • 特點： 軟離子化方法，產生的碎片離子少，適合分析不穩定的大分子；能產生多價離子；通常與 LC 聯用。

2. MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, 基質輔助雷射解吸/電離)

   • 工作原理：
     • 樣品製備： 將待測物與大量的基質 (matrix) 混合，基質通常是小分子量、能強烈吸收特定波長雷射光的有機酸 (如 3,5-二硝基苯甲酸, DHB)。將混合物沉積在金屬靶板上，形成薄膜。
     • 雷射照射： 用雷射 (通常是 337 nm 的氮氣雷射或 355 nm 的 Nd:YAG 雷射) 照射基質。
     • 基質吸收能量： 基質吸收雷射能量，快速加熱、汽化並膨脹，同時將能量傳遞給待測物分子。
     • 解吸與電離： 在基質的汽化過程中，待測物分子被解吸到氣相，並在此過程中發生質子轉移 (protonation) 或奪電子反應，形成帶電的離子。基質本身也會電離，有助於緩衝和離子傳輸。
     • 離子形成： MALDI 主要產生單價離子 (如 [M+H]⁺, [M+Na]⁺, [M-H]⁻)。
   • 應用：
     • 生物大分子質量測定： 蛋白質、肽類、寡核苷酸、多醣等，特別適合精確質量測定。
     • 材料科學： 聚合物分子量分佈。
     • 微生物鑑定。
     • 組織成像質譜 (Imaging MS)： 直接分析樣品表面。
   • 特點： 軟離子化方法；適合分析大分子；基質的作用是吸收雷射能量、緩衝、並幫助離子形成；樣品製備相對簡單；通常與飛行時間質譜儀 (TOF-MS) 聯用。

二、質量分析器 (Mass Analyzers)

(B) Quadrupole (四極桿) 和 Orbitrap (軌道阱)

1. 四極桿質量分析器 (Quadrupole Mass Analyzer)
   • 工作原理：
     • 由四根平行且等長的 rod 組成，形成一個四極場。
     • 兩對 rod 分別施加直流電壓 (DC) 和射頻交流電壓 (RF)。
     • 在 rod 之間形成一個動態的電場。

核心觀念

本題考兩個觀念：測量結果的信賴限與不確定度傳播。

重複測量可用樣本平均值 $\bar{x}$ 表示結果，用樣本標準差 $s$ 表示單次測量的離散程度。若要報告平均值的不確定度，標準誤為 $s/\sqrt{n}$；在母體標準差未知時，平均值的信賴區間以 $t$ 分布計算：

$$\bar{x} \pm t_{\alpha/2,\,n-1}\frac{s}{\sqrt{n}}$$

其中 $n$ 是測量次數，$t_{\alpha/2,\,n-1}$ 是自由度 $n-1$、指定信賴水準所對應的 $t$ 值。例如，95% 信賴區間的顯著水準為 $\alpha=0.05$。若已知母體標準差，則可改用常態分布的 $z$ 值。

解題方法

先由重複測量求平均值與標準差，再依所需信賴水準及測量次數查得臨界值，計算平均值的信賴限。報告時應列出測量結果、信賴限或不確定度、信賴水準及測量次數；例如可寫成「$\bar{x}\pm t_{\alpha/2,\,n-1}s/\sqrt{n}$，95% 信賴水準，$n$ 次測量」，並保留一致的單位與適當有效位數。

若 $x=f(p,q,r)$，且 $p,q,r$ 的標準差分別為 $S_p,S_q,S_r$，在各測量值彼此獨立時，依一階不確定度傳播公式：

$$S_x= \sqrt{ \left(\frac{\partial f}{\partial p}\right)^2S_p^2+ \left(\frac{\partial f}{\partial q}\right)^2S_q^2+ \left(\frac{\partial f}{\partial r}\right)^2S_r^2 }$$

若測量值彼此相關，還須加入共變異數項；上述公式適用於互相獨立的測量值。

本題指定：

$$x=\frac{pq}{r}$$

對各變數取偏導數：