114 年 國立成功大學環境醫學研究所乙組《化學儀器分析》

本題主要在考察 ESI-Orbitrap 質譜儀的工作原理與應用。

核心觀念： Orbitrap 質譜儀結合了電噴灑游離 (ESI) 的優點，以及 Orbitrap 質量分析器的獨特原理，能提供極高的解析度與質量準確度。

工作原理：

1. 離子源 (ESI - Electrospray Ionization):
   • 樣品溶液在高電壓下通過一個細小的噴嘴，形成帶電的液滴。
   • 溶劑蒸發、庫侖力排斥使得液滴分裂，最終產生帶電的離子。
   • ESI 適合分析極性、高分子量、熱不穩定性的化合物，且能產生多重帶電離子，有利於擴大質量電荷比 (m/z) 的範圍。
2. 離子導入與聚焦：
   • ESI 產生的離子會被導入質譜儀的真空系統。
   • 通常會經過一系列的離子透鏡，將離子聚焦並導向 Orbitrap 儲存器。
   • 在此過程中，許多中性分子和溶劑分子會被移除。
3. Orbitrap 質量分析器：
   • Orbitrap 儲存器由一個內部的「核心」電極和兩個外部的「軌道」電極組成。
   • 離子被注入到儲存器中，受到電場的作用，會在軌道電極周圍做螺旋運動，同時繞著核心電極進行振動。
   • 離子的振動頻率與其質量電荷比 (m/z) 成反比，即 $f \propto 1/\sqrt{m/z}$。
   • 這種振動會感應到外部電極上，產生一個微弱的電流訊號。

本題考查高解析度氣相層析-高解析度質譜儀 (HRGC-HRMS) 的定義，以及分析方法中六項數值標準的評估方法。

核心觀念： HRGC-HRMS 是痕量戴奧辛分析的金標準，其數值標準的評估是確保分析結果可靠性的關鍵。

HRGC-HRMS 的定義：
HRGC-HRMS (High-Resolution Gas Chromatography - High-Resolution Mass Spectrometry) 是一種聯用技術，結合了高解析度氣相層析 (HRGC) 和高解析度質譜儀 (HRMS)。

• HRGC： 使用高效率的氣相層析管柱（通常是毛細管柱）來分離複雜的樣品基質中的各個組分，特別是對於結構相似的戴奧辛同質異類物，HRGC 能夠提供極佳的分離度。
• HRMS： 使用能夠分辨出非常接近的質量電荷比 (m/z) 的質譜儀。對於戴奧辛這類化合物，通常需要能夠達到 10,000 以上的解析度 (R)，以便將目標離子與其他可能干擾的離子（如基質離子、同量異位素峰）區分開。

HRGC-HRMS 的組合能夠提供極高的選擇性、靈敏度和質量準確度，是測定環境和生物樣品中痕量戴奧辛的黃金標準方法。

分析方法的六項數值標準評估：
在測定痕量戴奧辛等物質的分析方法中，通常需要評估以下六項數值標準，以確保方法的適用性和結果的可靠性。這些標準的名稱和評估方法如下：

1. 準確度 (Accuracy):

   • 意義： 指測定值與真實值之間的一致性，即分析結果的正確程度。
   • 評估方法： 通常通過測定已知濃度標準品（如添加已知量戴奧辛的基質樣品，或使用認證參考物質 Certified Reference Material, CRM）的回收率來評估。回收率計算公式為：
     $\text{回收率} (\%) = \frac{\text{測定值} - \text{添加量}}{\text{添加量}} \times 100\%$
     或直接使用 CRM 的標示值與測定值比較。

2. 精密度 (Precision):

   • 意義： 指在相同條件下，重複測定同一試樣時，測定值之間的吻合程度，即結果的再現性。
   • 評估方法： 通常通過重複測定同一試樣（通常至少 5-7 次）來計算標準差 (Standard Deviation, SD) 或相對標準差 (Relative Standard Deviation, RSD)。
     $\text{RSD} (\%) = \frac{\text{SD}}{\text{平均值}} \times 100\%$
     精密度又可細分為重複性 (Repeatability, 在短時間內、同一實驗室、同一操作者、同一儀器) 和再現性 (Reproducibility, 在不同時間、不同實驗室、不同操作者、不同儀器)。

3. 檢測極限 (Limit of Detection, LOD):

   • 意義： 指分析方法能夠可靠檢測到的最低濃度（或量）。通常定義為訊號強度是背景訊號標準偏差的特定倍數（如 3 倍）。
   • 評估方法： 通常通過測定一系列低濃度樣品或空白樣品，計算背景訊號的標準偏差 ($s_0$)，然後使用公式：
     $\text{LOD} = 3 \times s_0$
     或使用訊號與訊噪比 (S/N) 的關係來確定。對於 HRGC-HRMS，由於其高靈敏度，LOD 通常可以達到 pg 或 fg 的等級。

4. 定量極限 (Limit of Quantitation, LOQ):

   • 意義： 指分析方法能夠可靠定量測定的最低濃度（或量）。通常定義為訊號強度是背景訊號標準偏差的特定倍數（如 10 倍），或是訊號與訊噪比達到特定值（如 10:1）。
   • 評估方法： 與 LOD 類似，但使用更高的倍數或 S/N 比。
     $\text{LOQ} = 10 \times s_0$

本題主要考查層析與質譜分析中「解析度」(Resolution) 的計算方法及其差異性。

核心觀念： 解析度是衡量分離能力的重要指標，但層析與質譜的解析度定義與計算方式不同，原因在於它們分離的基礎物理原理不同。

(A) 層析解析度 (Chromatographic Resolution, $R_s$) 的計算：
層析解析度用於衡量兩個相鄰層析峰的分離程度。定義為兩個峰的峰底之間距離與平均峰寬的比例。
$R_s = \frac{2(t_{R2} - t_{R1})}{w_{b1} + w_{b2}}$
其中：

• $t_{R1}$ 和 $t_{R2}$ 分別是兩個相鄰組分（峰 1 和峰 2）的滯留時間 (retention time)。
• $w_{b1}$ 和 $w_{b2}$ 分別是兩個峰的峰底寬度 (base width)。

通常，為了簡化計算，假定兩個峰的峰寬大致相等 ($w_{b1} \approx w_{b2} \approx w_b$)，則公式可簡化為：
$R_s = \frac{2(t_{R2} - t_{R1})}{w_b}$

• 判斷標準：
  • $R_s = 1.0$：兩個峰的峰底分離 70.7%。
  • $R_s = 1.5$：兩個峰的峰底幾乎完全分離（99.3%）。
  • $R_s < 1.0$：兩個峰有重疊。

(B) 質量解析度 (Mass Spectrometric Resolution, $R$ 或 $m/\Delta m$) 的計算：
質譜解析度用於衡量質譜儀分辨出兩個質量非常接近的離子的能力。定義為兩個離子質量差的兩倍與其中一個離子質量的比值，或者定義為特定質量值與該質量值峰寬 (FWHM) 的比值。

• 定義 1 (基於質量差)：
  $R = \frac{m_1 + m_2}{2(m_1 - m_2)}$
  其中 $m_1$ 和 $m_2$ 是兩個可被分辨的離子質量，通常要求兩個峰之間的谷底高度不低於峰高的 50%（或 10%）。

• 定義 2 (基於峰寬，最常用)：
  $R = \frac{m}{\Delta m}$
  其中：

  • $m$ 是離子的質量電荷比 (m/z)。
  • $\Delta m$ 是該離子峰的峰寬，通常定義為全寬度 at half maximum (FWHM)。

• 判斷標準：

  • 例如，若質譜儀的解析度為 10,000，則它可以分辨出 m/z = 1000 的兩個離子，其質量差需大於 $1000 / 10000 = 0.1$ amu。

(C) 計算程序差異的原因、優缺點討論：

1. 程序差異的原因：

• 層析分離原理： 層析的分離是基於組分在固定相和流動相之間分配係數或吸附能力的差異，導致它們在時間上（滯留時間）產生差異。解析度計算關注的是時間軸上的峰間距離和峰寬。
• 質譜分離原理： 質譜的分離是基於離子的質量電荷比 (m/z)。

本題考查光譜儀的種類、結構，以及雷射誘導螢光 (LIF) 與紫外-可見吸收 (UV-VIS) 檢測器在液相層析中的靈敏度差異。

核心觀念： 光譜儀利用光源、樣品與檢測器之間的相互作用來分析物質。不同類型的光譜儀有不同的組件配置。LIF 檢測器因其高靈敏度，在痕量分析中具有優勢。

三種最常見的光學光譜儀類型：

1. 吸收光譜儀 (Absorption Spectrometer)
2. 發射光譜儀 (Emission Spectrometer)
3. 螢光光譜儀 (Fluorescence Spectrometer)

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1. 吸收光譜儀 (Absorption Spectrometer)

• 工作原理： 測量樣品對特定波長光的吸收程度。

• 組成方塊圖：

  +----------+     +-----------+     +---------+     +------------+     +----------+
  |  光源    | --> |  單色儀   | --> |  樣品池 | --> |  檢測器    | --> |  數據處理|
  | (Light   |     | (Monochro-|     | (Sample |     | (Detector) |     | (Data     |
  | Source)  |     | mator)    |     | Cell)   |     |            |     | Processing)|
  +----------+     +-----------+     +---------+     +------------+     +----------+
  

  • 光源 (Light Source): 提供特定波長範圍的光，如鹵素燈 (VIS)、氘燈 (UV)、氙燈 (UV-VIS)。
  • 單色儀 (Monochromator): 將光源的光分離成單色光（單一波長），並允許選擇所需波長。通常包含光柵 (grating) 或稜鏡 (prism)。
  • 樣品池 (Sample Cell): 放置樣品，光束穿過樣品。材質需對光透明（如石英用於 UV-VIS）。
  • 檢測器 (Detector): 測量穿過樣品的光的強度 (I)，與未穿過樣品的參考光強度 ($I_0$) 比較。常見的有光電倍增管 (PMT)、光電二極體 (Photodiode)。
  • 數據處理 (Data Processing): 計算吸光度 (Absorbance, A) 或透光率 (Transmittance, T)。
    $A = -\log(T) = \log(I_0/I)$
    Beer-Lambert Law: $A = \epsilon b c$

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2. 發射光譜儀 (Emission Spectrometer)

• 工作原理： 樣品被激發後發出特定波長的光，測量其發射光的強度。

• 組成方塊圖：

  +----------+     +---------+     +-----------+     +------------+     +----------+
  |  激發源  | --> |  樣品   | --> |  單色儀   | --> |  檢測器    | --> |  數據處理|
  | (Excitation|     | (Sample)|     | (Monochro-|     | (Detector) |     | (Data     |
  | Source)  |     |         |     | mator)    |     |            |     | Processing)|
  +----------+     +---------+     +-----------+     +------------+     +----------+
  

  • 激發源 (Excitation Source): 提供能量激發樣品，如電弧 (Arc)、火花 (Spark)、電漿 (Plasma, ICP)、雷射 (Laser)。
  • 樣品 (Sample): 樣品在此處被激發。
  • 單色儀 (Monochromator): 分離樣品發出的不同波長的光，並選擇特定波長進行測量。
  • 檢測器 (Detector): 測量特定波長發射光的強度。
  • 數據處理 (Data Processing): 產生發射光譜，即強度對波長或波數的圖。

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3. 螢光光譜儀 (Fluorescence Spectrometer)

• 工作原理： 樣品吸收特定波長的光後，再發出較長波長的光（螢光），測量其螢光強度。
• 組成方塊圖：

本題考查範德姆特 (van Deemter) 方程，要求繪製氣相層析 (GC) 和液相層析 (HPLC) 的範德姆特圖，解釋方程中的各項係數，並討論顆粒大小對 HPLC 柱效率和壓力的影響。

核心觀念： 範德姆特方程描述了傳質阻力（流速、擴散、填料）對層析柱效率的影響。GC 和 HPLC 的範德姆特圖因流動相性質和傳質機制差異而有所不同。

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範德姆特方程 (van Deemter Equation):
範德姆特方程描述了柱效理論板高度 ($H$) 與載流子線速度 ($u$) 之間的關係：
$H = A + \frac{B}{u} + C u$
其中：

• $H$：理論板高度 (Height Equivalent to a Theoretical Plate, HETP)，單位通常是 cm。$H$ 越小，柱效率越高。
• $u$：載流子（流動相）的線速度 (linear velocity)，單位通常是 cm/s。
• $A$：多路徑效應 (Eddy diffusion or multiple path effect)。
• $B$：縱向擴散效應 (Longitudinal diffusion)。
• $C$：傳質阻力效應 (Mass transfer resistance)，包括流動相和固定相的傳質。

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A, B, C 項的意義：

• A 項 (多路徑效應)：

  • 意義： 在填充柱中，流動相的分子可以通過多條不同的路徑流過填料顆粒之間的空隙。這些路徑的長度不同，導致組分到達固定相的速度不同，造成峰展寬。
  • 影響因素： 與填料顆粒的大小、填充的均勻度、柱的直徑有關。顆粒越小、填充越均勻，A 值越小。
  • 公式近似： $A \approx 2 \pi d_p$ (其中 $d_p$ 是顆粒直徑)。

• B 項 (縱向擴散效應)：

  • 意義： 在流動相中，即使在沒有流速的情況下，組分分子也會發生隨機的熱運動（布朗運動），這會導致組分在流動方向上發生擴散，尤其是在低流速時，分子有更多時間進行縱向擴散，造成峰展寬。
  • 影響因素： 與流動相的擴散係數 ($D_m$) 和流速 ($u$) 有關。流速越低，B 項越大。
  • 公式近似： $B = \frac{2 D_m}{\gamma}$ (其中 $\gamma$ 是與柱相關的常數)。

• C 項 (傳質阻力效應)：

  • 意義： 組分從流動相轉移到固定相（吸附或溶解）以及從固定相轉移回流動相的過程需要時間。當流速較高時，組分在流動相中移動得很快，但未能及時與固定相充分交換，或者從固定相中解吸出來，導致滯後，造成峰展寬。C 項包含了流動相傳質 ($C_f$) 和固定相傳質 ($C_s$)。
  • 影響因素： 與顆粒大小 ($d_p$)、固定相厚度、流速 ($u$)、流動相和固定相的擴散係數有關。流速越高，C 項越大。
  • 公式近似： $C = C_f u + C_s u = (C_{f,0} + C_{s,0}) u$ (其中 $C_{f,0}$ 和 $C_{s,0}$ 是與流速無關的常數)。

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繪製範德姆特圖 (Hypothetical van Deemter Plots):

• X 軸： 流動相線速度 ($u$)
• Y 軸： 理論板高度 ($H$)

1. 氣相層析 (GC) 的範德姆特圖：
* 特點：
* GC 的流動相是氣體，其縱向擴散係數 ($D_m$) 相對較大。
* 低流速時，B 項 ($B/u$) 佔主導，H 值較高。
* 隨著流速增加，B 項減小，A 項和 C 項逐漸佔優，H 值先減小至最小值 (最佳流速)，然後隨流速增加而增大。
* 最佳流速通常較低。
* 圖形： 呈現一個 U 形曲線，最小值出現在較低的流速範圍。

```
      ^ H (板高)
      |
      |      /------- C u
      |     /
      |    /
      |   /
      |  /
      | / A (常數)
      |/
------+-------------------> u (線速度)
     / \
    /   \ B/u
   /     \
  /       \
 /         \
(最佳流速)
```

2. 液相層析 (HPLC) 的範德姆特圖：
* 特點：
* HPLC 的流動相是液體，其縱向擴散係數 ($D_m$) 相對較小。