115 年 國立成功大學環境醫學研究所乙組《化學儀器分析》

范第姆特方程式（Van Deemter equation）是色譜學中描述傳質過程與柱效應之間關係的經典方程式，用於解釋在特定流速下，色譜柱的傳質阻力（或稱頻寬因子）與流速之間的關係，進而影響分離效率。

方程式形式為：
$H = A + \frac{B}{u} + C u$

其中：

• $H$：理論塔板高度 (Height equivalent to a theoretical plate, HETP)，單位通常為 cm/plate 或 m/plate。$H$ 值越小，表示分離效率越高。
• $u$：流動相的線流速 (Linear velocity of mobile phase)，單位通常為 cm/s 或 m/s。
• $A$：渦流擴散項 (Eddy diffusion term)，與管柱填料的均勻性、顆粒大小分佈、填裝方式有關，表示樣品分子在管柱中通過不同路徑時產生的擴散。此項與流速 $u$ 無關。
• $B$：縱向擴散項 (Longitudinal diffusion term)，與流動相的擴散係數和管柱長度有關，表示樣品分子在流動相中沿著流動方向的擴散。此項與流速 $u$ 成反比。
• $C$：傳質阻力項 (Mass transfer term)，與流動相和固定相之間的傳質係數、流速、填料顆粒大小、流動相黏度等有關，表示樣品分子在流動相和固定相之間分配平衡所需的時間。此項與流速 $u$ 成正比。

粒徑對分離效率及流動相壓力的影響：

1. 粒徑與分離效率 (H 值)：
   • A 項 (渦流擴散)： 較小的、均勻的填料顆粒有助於減少 A 項的影響，因為可以形成更均勻的流路，減少分子在不同路徑上停留時間的差異。因此，較小的粒徑通常能提高分離效率。

這題考驗對三種不同光譜分析技術（吸收光譜、螢光光譜、化學冷光光譜）基本原理、儀器組成及應用的理解。

核心觀念：

• 吸收光譜：基於物質對特定波長光的吸收能力。
• 螢光光譜：基於物質吸收光能後，電子躍遷至激態，再回到基態時發射出較長波長光的現象。
• 化學冷光光譜：基於化學反應過程中釋放的能量，使產物分子處於激發態，再回到基態時發射出光。

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一、 吸收光譜儀 (Absorption Spectrophotometer)

• 基本原理： 當光通過含有特定吸收物質的樣品溶液時，部分光會被樣品吸收，未被吸收的光透過樣品。吸收的程度與樣品的濃度及光通過的路徑長度成正比（Lambert-Beer's Law）。

  • $A = -\log_{10} (\frac{I}{I_0}) = \epsilon b c$
    • $A$：吸光度 (Absorbance)
    • $I_0$：入射光強度 (Intensity of incident light)
    • $I$：透射光強度 (Intensity of transmitted light)
    • $\epsilon$：莫耳吸光係數 (Molar absorptivity)，與物質本身特性及波長有關。
    • $b$：光徑長度 (Path length)，即樣品池的寬度。
    • $c$：樣品濃度 (Concentration)。

• 必要組成元件及排列幾何位置：

  1. 光源 (Light Source)： 提供特定波長範圍的光。
     • 可見光/紫外光區：鎢絲燈 (Tungsten lamp, 350-1100 nm) 或氘燈 (Deuterium lamp, 200-400 nm)。
     • 紅外光區：白熾燈、鎳鉻絲加熱器等。
  2. 單色器 (Monochromator)： 將光源發出的多色光分離成單一波長的光。
     • 組成：狹縫 (Slit)、稜鏡 (Prism) 或繞射光柵 (Diffraction grating)。
     • 作用：選擇特定波長的光照射樣品。
  3. 樣品室 (Sample Compartment)： 放置樣品池。
     • 樣品池 (Cuvette)：通常為石英 (Quartz) 或玻璃 (Glass) 製成，有固定光徑長度（常見為 1 cm）。
  4. 偵測器 (Detector)： 偵測通過樣品的透射光強度。
     • 常見類型：光電管 (Phototube)、光電倍增管 (Photomultiplier tube, PMT)、光二極體 (Photodiode)。
  5. 訊號處理與顯示器 (Signal Processor & Display)： 將偵測器接收到的訊號轉換為吸光度或透光度，並顯示出來。

• 排列幾何位置：
  光源 → 單色器 → 樣品室 → 偵測器
  （光沿著直線方向依次通過各元件）

• 應用實例：

  • 水質分析：測定水中特定離子（如硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽）或有機物的含量。
  • 藥物分析：測定藥品溶液的濃度，檢查藥物純度。
  • 食品分析：測定食品中的色素、營養成分（如維生素 A、胡蘿蔔素）含量。
  • 生化分析：測定蛋白質、核酸的濃度（如 A260/A280 比值）。

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二、 螢光光譜儀 (Fluorometer / Spectrofluorometer)

• 基本原理： 樣品分子吸收激發光 (Excitation light) 後，電子躍遷到較高能量的激發態。當這些激發態分子回到基態時，部分能量會以發射光 (Emission light) 的形式釋放出來，此現象稱為螢光。螢光光的波長通常比激發光長。
  • 激發光：能量較高，波長較短。
  • 發射光：能量較低，波長較長。

這題主要探討紅外光譜法（IR）與拉曼光譜法（Raman）這兩種與分子振動有關的光譜技術，涵蓋其基本原理、差異及應用。

核心觀念：

• IR 和 Raman 光譜都是利用分子振動來獲取結構資訊。
• 分子振動是分子中原子相對運動的結果，其頻率與原子質量、鍵的強度及鍵的類型有關。
• IR 和 Raman 光譜的產生依賴於分子振動對電磁場的影響方式不同。

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一、 紅外線吸收光譜法 (Infrared Absorption Spectroscopy, IR)

• 基本原理：

  • 當分子吸收特定頻率的紅外線輻射時，其振動能階會發生躍遷。
  • 要實現紅外線吸收，分子必須具有偶極矩的變化。也就是說，在振動過程中，分子的偶極矩必須發生改變。
  • 例如，一個對稱的鍵（如 O=O, N≡N）在振動時，其偶極矩不變，因此無法與紅外線發生作用。而不對稱的鍵（如 C=O, O-H, C-H）在振動時，偶極矩會改變，因此可以吸收紅外線。

• 儀器組成（簡述）：

  • 紅外線光源 → 單色器（選擇特定波長） → 樣品（吸收紅外線） → 偵測器（偵測透射光強度） → 數據處理。

• 應用範圍：

  • 結構鑑定： 鑑定有機物、無機物、聚合物的結構，特別是官能基的識別（如 O-H, C=O, N-H, C-H 等的特徵吸收峰）。
  • 定性分析： 比較未知樣品的光譜與標準品光譜，判斷物質的種類。
  • 定量分析： 測量特定官能基的含量，根據 Lambert-Beer's Law 計算濃度。
  • 化學反應監測： 追蹤反應過程中官能基的生成與消失。

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二、 拉曼光譜法 (Raman Spectroscopy)

• 基本原理：

  • 當分子受到單色光（通常是可見光或近紅外光）照射時，大部分光會被彈性散射（瑞利散射，Rayleigh scattering），波長不變。
  • 但有一小部分光會發生非彈性散射，稱為拉曼散射 (Raman scattering)。
  • 在拉曼散射過程中，入射光與分子發生能量交換，導致散射光的波長發生改變。
  • 要產生拉曼散射，分子必須具有極化率的變化。也就是說，在振動過程中，分子的極化率必須發生改變。極化率是分子在外電場作用下，電子雲分佈發生變化的難易程度。
  • 對稱性高的分子（如 O=O, N≡N）在振動時，其極化率會發生顯著變化，因此在拉曼光譜中會有較強的信號。

• 儀器組成（簡述）：

  • 雷射光源（提供高強度單色光） → 樣品（散射光） → 濾光片（濾除瑞利散射光） → 單色器/光柵（分離不同波長的拉曼散射光） → 偵測器（偵測拉曼散射光強度） → 數據處理。

• 應用範圍：

  • 結構鑑定： 鑑定有機物、無機物、聚合物結構，特別是分析對稱性高的鍵或官能基（如 C-C 鍵、S-S 鍵、芳香環）。
  • 無損檢測： 可透過玻璃、塑膠容器進行分析，樣品製備簡單，對樣品破壞小。
  • 水溶液分析： 由於使用可見光作為激發光源，且水在可見光區吸收很弱，因此拉曼光譜法非常適合分析水溶液中的樣品，而 IR 在水溶液中會受到強烈的吸收干擾。
  • 顯微拉曼 (Micro-Raman)： 可進行高空間解析度的成像分析，用於細胞、材料表面等。
  • 鑑別困難的同分異構體： 有時 IR 難以區分的同分異構體，通過拉曼光譜可以區分。

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三、 紅外光譜法與拉曼光譜法的基本差異：

| 特性 | 紅外線吸收光譜法 (IR) | 拉曼光譜法 (Raman) |

這題考驗對質譜儀中兩種重要游離技術：電子游離 (Electron Ionization, EI) 和電噴灑游離 (Electrospray Ionization, ESI) 的原理及應用的掌握。

核心觀念：

• 質譜儀的核心是通過測定離子的質荷比 (m/z) 來鑑定和定量物質。
• 在測定質荷比之前，樣品分子必須被轉化為離子。游離源的任務就是將中性的樣品分子轉化為離子。
• EI 和 ESI 是兩種截然不同的游離方式，適用於不同性質的樣品。

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一、 電子游離源 (Electron Ionization, EI)

• 工作原理：

  1. 樣品導入： 樣品通常以氣態形式導入游離室（需要樣品具有一定的揮發性）。
  2. 電子束轟擊： 在高真空的游離室中，樣品氣體分子受到一束高能電子束（通常能量為 70 eV）的轟擊。
  3. 離子化： 當高能電子與樣品分子碰撞時，會將一個或多個電子從樣品分子中擊出，從而產生帶正電的分子離子（M$^+$•）。
     • $M + e^- \xrightarrow{70 eV} M^{+\bullet} + 2e^-$
  4. 碎片化： 產生的分子離子通常是高能量的，其結構不穩定，容易發生斷鍵，產生一系列的碎片離子 (fragment ions) 和中性碎片。
     • $M^{+\bullet} \rightarrow \text{fragment ions} + \text{neutral fragments}$
  5. 質荷比分析： 這些分子離子和碎片離子隨後被加速，並進入質譜儀的質量分析器進行分離和檢測。

• 特點：

  • 高能量游離： 70 eV 的能量相對較高，容易引起樣品分子的碎片化。
  • 產生碎片離子： 碎片離子譜圖是 EI 的一個重要特徵，它提供了豐富的結構信息，常用於物質的結構鑑定（指紋譜）。
  • 適用範圍： 主要適用於揮發性、熱穩定性較好的有機化合物。
  • 缺點： 對於一些不穩定或揮發性差的分子，可能無法產生分子離子峰，或分子離子峰很弱，不利於分子量的測定。

• 在化學分析上的應用實例：

  • 有機物鑑定： 結合氣相層析儀 (GC-MS)，廣泛用於鑑定環境污染物、食品添加劑、藥物、香料等有機化合物的結構。其標準化的碎片質譜圖（如 NIST 質譜資料庫）是物質鑑定的重要依據。
  • 代謝組學研究： 分析生物樣品中的小分子代謝產物。
  • 高分子分析： 對於一些可氣化的低分子量聚合物或單體分析。

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二、 電噴灑游離源 (Electrospray Ionization, ESI)

• 工作原理：
  1. 樣品溶液： 樣品溶解在極性溶劑中（如甲醇、乙腈、水等，常加入少量酸或鹼以促進質子化或去質子化）。

這題是一個綜合性的實驗設計與分析問題，涵蓋了儀器原理、實驗操作、數據處理及問題排除，特別強調了解析湖水中苯胺的定性定量分析。

核心觀念：

• 液相層析儀 (HPLC) 的分離原理：利用流動相和固定相之間的分配差異將混合物分離。
• 電化學偵測器 (ECD) 的原理：利用化合物的氧化還原反應產生電流信號。
• 定性與定量分析的標準：色譜峰的保留時間（定性）和峰面積/高度（定量）。
• 量測不確定度：評估分析結果的可靠性。
• 干擾排除：處理未知訊號對目標物分析的影響。

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A. 向普通化學程度的同仁說明 HPLC 與 ECD 的原理

1. 液相層析儀 (HPLC) 的原理說明：

「想像一下，我們要從一大堆不同種類的樂高積木（湖水裡的各種成分，包括我們想找的苯胺）中，找出特定的一種藍色樂高積木（苯胺）。HPLC 就像一個非常精密的『積木分類機』。」

• 主要部分：

  • 幫浦 (Pump)： 負責把特殊的「清潔液」（稱為流動相，像水一樣，但我們可能會加一些東西讓它更容易把積木沖出來）穩定地打進去。
  • 進樣器 (Injector)： 負責把我們想分析的「樂高積木混合物」（湖水樣本）精準地注入到流動相裡面。
  • 管柱 (Column)： 這是分類機的核心！裡面裝滿了非常非常細小的「篩網」或「黏膠」（稱為固定相）。管柱的設計讓不同的積木在通過這些篩網或黏膠時，會以不同的速度前進。
    • 有些積木（成分）比較喜歡和篩網（固定相）玩，就會走得比較慢。
    • 有些積木（成分）比較喜歡和清潔液（流動相）玩，就會走得比較快。
    • 所以，當混合物通過管柱時，不同的積木就會因為前進速度不同而一個接一個地「跑」出來。
  • 偵測器 (Detector)： 就像一個「點數機」，當積木從管柱跑出來時，它會偵測到並發出一個「嗶」聲（訊號），記錄下什麼時候有東西跑出來，以及跑出來的量有多少。

• 總結： HPLC 就是利用不同的物質在流動相和固定相之間的「親疏程度」不同，讓它們在管柱中以不同的速度移動，最終達到分離的目的。

2. 電化學偵測器 (ECD) 的原理說明：

「剛剛說的『點數機』（偵測器），我們用的是一種叫做『電化學偵測器』的。它的原理是利用『化學反應』來『發電』，然後測量這個『電』的大小。」

• 基本概念：

  • 很多化學物質，像是我們找的苯胺，它有一個特殊的結構，可以跟電產生「互動」，也就是說，它可以在電極表面發生「氧化」或「還原」的化學反應。
  • 想像一下，我們在偵測器裡面放了兩個「電極」（就像電池的正負極，但這裡是用來感應化學反應的）。
  • 當我們想測的物質（例如苯胺）通過這個區域時，它會在其中一個電極上發生化學反應（例如被氧化）。
  • 這個化學反應會產生微小的「電流」。
  • 這個電流的大小，會跟通過的苯胺的「量」有關。如果通過的苯胺越多，產生的電流就越大；通過的苯胺越少，電流就越小。

• 如何應用：

  • 當 HPLC 把苯胺從管柱分離出來，送到 ECD 時，ECD 就會偵測到這個化學反應產生的電流。
  • 這個電流的大小，就可以告訴我們有多少苯胺跑出來了。
  • 而且，我們知道苯胺大約會在什麼時候從管柱跑出來（這個時間點是固定的，就像它的「身份證號碼」），所以當我們看到那個時間點有電流訊號時，就知道是苯胺。

• 總結： ECD 偵測器就是利用特定化學物質（如苯胺）在電極上發生氧化還原反應時產生的電流大小，來判斷物質的「量」，並利用它跑出來的時間點來確認它的「身份」。

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B. 化學定性、定量分析程序、判別標準與量測不確定度

1. 分析程序：

• 樣品前處理：

  • 過濾： 將湖水樣本通過濾膜（如 0.45 µm 或 0.22 µm）去除顆粒物，防止堵塞管柱和儀器。
  • 溶劑選擇： 選擇適合 HPLC 和 ECD 的流動相。對於分析苯胺，常用是水/有機溶劑（如甲醇或乙腈）的混合物，並可能加入緩衝劑或離子對試劑以優化分離和 ECD 響應。
  • 進樣濃度： 根據初步估計或試驗，調整樣品濃度，確保苯胺的濃度在 ECD 的偵測範圍內，且不會過載。必要時進行樣品稀釋或濃縮。

• 儀器設定：

  • 流動相配製與沖洗： 配製高純度流動相，並用其充分沖洗 HPLC 系統，排除空氣和雜質。
  • 管柱選擇： 選擇反相 C18 或 C8 管柱，因為苯胺為弱鹼性，在酸性或中性條件下易質子化，可在反相管柱上獲得良好保留。
  • 流動相梯度/等度洗脫：
    • 等度洗脫 (Isocratic elution)： 流動相組成固定。適用於樣品組分極性差異較大且分離度足夠的情況。
    • 梯度洗脫 (Gradient elution)： 流動相組成隨時間變化。對於複雜樣品（如湖水）或組分極性差異不大時，可提供更好的分離效果。
  • 流速設定： 設定合適的流速（例如 0.5-1.5 mL/min），以平衡分離效率和分析時間。
  • 偵測器設定：
    • 電位設定 (Potential setting)： 這是 ECD 最關鍵的參數。需要針對苯胺進行優化，找到使其氧化還原反應最靈敏的電位。通常通過掃描電位來尋找響應峰值。
    • 靈敏度設定 (Sensitivity/Range)： 根據樣品濃度選擇合適的範圍。
    • 其他參數： 如流動池溫度、時間常數等。

• 分析步驟：

  1. 系統穩定： 啟動儀器，待流動相流動穩定，基線平穩後，開始分析。
  2. 空白樣品進樣： 進樣處理過的湖水空白樣品（不含苯胺，但經過相同前處理），記錄基線，確認無干擾峰。
  3. 標準品溶液進樣：
     • 定性標準： 進樣已知濃度的苯胺標準品溶液，記錄其保留時間（tR）。
     • 定量標準： 進樣一系列不同濃度的苯胺標準品溶液（至少 3-5 個濃度點），記錄其保留時間和對應的峰面積或峰高。
  4. 樣品進樣： 進樣處理過的湖水樣品，記錄其保留時間和峰面積/高度。
  5. 重複進樣： 為評估穩定性，可重複進樣標準品和樣品。

2. 定性與定量分析的判別標準：

• 定性判別標準：
  • 保留時間 (Retention Time, tR)： 樣品峰的保留時間必須與相同條件下測得的苯胺標準品峰的保留時間高度一致。通常要求兩者之間的差異在一個很小的範圍內（例如 ± 0.1 分鐘或 ± 1% 的保留時間），且峰形（對稱性、寬度）也應相似。