112 年 國立成功大學臨床藥學與藥物科技研究所乙組《生物化學》

蛋白質的二級結構（Secondary structure）是指多肽鏈局部空間的規則性結構，主要包括 $\alpha$-helix（ $\alpha$-螺旋）和 $\beta$-sheet（ $\beta$-摺疊）。這些結構的形成是由於多肽鏈骨架原子（主要是羰基氧和亞胺基氮）之間形成的氫鍵所致。

• $\alpha$-helix：多肽鏈捲曲成螺旋狀，相鄰的氨基酸殘基之間，肽鍵的羰基氧與四個殘基之後的肽鍵的亞胺基氮之間形成氫鍵。

這題考驗的是分子生物學中常用的核酸檢測技術。這些技術都是基於核酸雜交（hybridization）的原理，利用特異性的探針（probe）來檢測目標核酸分子。

• 北方墨點法 (Northern blotting)：用於檢測 RNA 分子。將 RNA 分子從凝膠電泳分離後轉移到膜上，再用標記的 DNA 或 RNA 探針進行雜交，以檢測特定 RNA 的存在和豐度。
• 南方墨點法 (Southern blotting)：用於檢測 DNA 分子。

細胞內主要使用的直接能量來源是 ATP（三磷酸腺苷）。ATP 是一種高能磷酸化合物，其分子中的兩個末端磷酸鍵（酸酐鍵）水解時能釋放大量的自由能，這些能量可以直接被細胞內的各種耗能過程（如肌肉收縮、主動運輸、生物合成等）所利用。

這題考驗的是不同組織對能量來源的代謝偏好和限制。

• 大腦 (Brain)：大腦是人體耗能最多的器官之一，其主要的能量來源是葡萄糖。在正常情況下，大腦幾乎完全依賴葡萄糖供能，即使在長時間飢餓狀態下，大腦也能利用酮體作為能量來源，但酮體也源自脂肪酸在肝臟的代謝。大腦缺乏脂肪酸的氧化酶系統，因此不能直接利用脂肪酸作為能量來源。
• 肌肉 (Muscle)：肌肉在休息狀態下可以利用脂肪酸和葡萄糖作為能量來源。

DNA（脫氧核糖核酸）的核酸序列是由四種含氮鹼基組成的，分別是腺嘌呤 (Adenine, A)、胸腺嘧啶 (Thymine, T)、胞嘧啶 (Cytosine, C) 和鳥糞嘌呤 (Guanine, G)。這四種鹼基通過磷酸二酯鍵連接成多核苷酸鏈。

胺基酸是構成蛋白質的基本單位，它們的結構通常包含一個中心碳原子（$\alpha$-碳），連接一個胺基（$-\text{NH}_2$）、一個羧基（$-\text{COOH}$）、一個氫原子（$-\text{H}$）和一個側鏈基團（R基）。R基的結構決定了胺基酸的種類和性質。

胺基酸的大小主要由其 R 基決定。

• 甘氨酸 (Glycine, Gly)：其 R 基就是一個氫原子（$-\text{H}$）。這是所有標準胺基酸中最簡單、最小的結構。

DNA 複製是一個複雜的過程，需要多種酶的協同作用來準確地複製遺傳信息。

• DNA 聚合酶 (DNA Polymerase)：是 DNA 複製的核心酶，負責合成新的 DNA 鏈，它以親代 DNA 為模板，按照鹼基互補配對原則，將核苷酸逐一添加到新的 DNA 鏈上。
• DNA 連接酶 (DNA ligase)：在 DNA 複製過程中，由於 DNA 聚合酶只能沿 5' 到 3' 方向合成，因此滯後鏈（lagging strand）會產生岡崎片段（Okazaki fragments）。DNA 連接酶負責將這些片段連接起來，形成連續的 DNA 鏈。

鹽溶 (Salting in) 和鹽析 (Salting out) 是利用高濃度鹽離子來改變蛋白質溶解度的兩種相反的現象，常用於蛋白質的分離和純化。

一、 鹽析 (Salting out)

• 操作過程：

  1. 將蛋白質溶液的離子強度逐漸提高，通常是加入高濃度的鹽（如硫酸銨 $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$）。
  2. 當鹽濃度達到一定程度時，蛋白質的溶解度會顯著下降，並開始沉澱析出。
  3. 通過離心分離，可以將沉澱的蛋白質與溶液分離。
  4. 可以通過逐步增加鹽濃度，分步沉澱不同溶解度的蛋白質，從而達到分離的目的。

• 作用原理：
  在高濃度的鹽溶液中，鹽離子（陽離子和陰離子）會與蛋白質表面的電荷發生競爭。這些鹽離子會強烈地水合，形成一層水合殼，包圍在蛋白質分子周圍。

  1. 離子競爭水分子：鹽離子會大量地結合水分子，使得原本包圍在蛋白質表面的水分子減少。蛋白質表面的水分子對於維持蛋白質的溶解度至關重要，因為它們能屏蔽蛋白質分子之間的靜電相互作用，並隔離蛋白質與蛋白質之間的直接接觸。
  2. 降低蛋白質的靜電斥力：隨著水分子減少，蛋白質分子之間相互作用的靜電斥力減弱，而分子間的范德華力等吸引力變得相對更重要。
  3. 蛋白質分子聚集沉澱：當鹽濃度足夠高時，蛋白質分子之間的吸引力超過了它們與水之間的親和力，蛋白質分子就會聚集在一起，形成大的聚集體，最終沉澱析出。

檸檬酸循環（Citric Acid Cycle），又稱克雷布斯循環（Krebs Cycle）或三羧酸循環（TCA Cycle），是細胞呼吸過程中產生能量（ATP）的核心階段。它發生於線粒體基質中，將乙醯輔酶A（Acetyl-CoA）徹底氧化，產生 $\text{CO}_2$、少量 ATP（或 GTP）、以及大量的還原型輔酶 NADH 和 $\text{FADH}_2$，這些還原型輔酶將在後續的氧化磷酸化中產生大量的 ATP。

以下是檸檬酸循環的幾個關鍵步驟、原料和產物：

關鍵步驟與原料/產物：

1. 乙醯輔酶A (Acetyl-CoA) 與草醯乙酸 (Oxaloacetate) 縮合：

   • 原料：乙醯輔酶A (2碳) + 草醯乙酸 (4碳)
   • 關鍵酶：檸檬酸合成酶 (Citrate synthase)
   • 產物：檸檬酸 (Citrate, 6碳)
   • 說明：這是檸檬酸循環的起始反應。乙醯輔酶A 的乙醯基與草醯乙酸縮合，形成檸檬酸。輔酶A (CoA) 被釋放。

2. 檸檬酸 (Citrate) 異構化為異檸檬酸 (Isocitrate)：

   • 原料：檸檬酸 (6碳)
   • 關鍵酶：烏頭酸酶 (Aconitase)
   • 產物：異檸檬酸 (Isocitrate, 6碳)
   • 說明：通過脫水和再水合反應，將檸檬酸轉化為異構體異檸檬酸，為後續的氧化脫羧反應做準備。

3. 異檸檬酸 (Isocitrate) 氧化脫羧生成 $\alpha$-酮戊二酸 ( $\alpha$-Ketoglutarate)：

   • 原料：異檸檬酸 (6碳)
   • 關鍵酶：異檸檬酸脫氫酶 (Isocitrate dehydrogenase)
   • 產物：
     • $\alpha$-酮戊二酸 ( $\alpha$-Ketoglutarate, 5碳)
     • $\text{CO}_2$ (1分子)
     • $\text{NADH}$ (1分子，來自 $\text{NAD}^+$ 的還原)
   • 說明：這是檸檬酸循環中第一個氧化脫羧反應，釋放一分子 $\text{CO}_2$ 並產生一分子 $\text{NADH}$。

4. $\alpha$-酮戊二酸 ( $\alpha$-Ketoglutarate) 氧化脫羧生成琥珀醯輔酶A (Succinyl-CoA)：

   • 原料：$\alpha$-酮戊二酸 (5碳)
   • 關鍵酶：$\alpha$-酮戊二酸複合體 ( $\alpha$-Ketoglutarate dehydrogenase complex)
   • 產物：
     • 琥珀醯輔酶A (Succinyl-CoA, 4碳)
     • $\text{CO}_2$ (1分子)
     • $\text{NADH}$ (1分子，來自 $\text{NAD}^+$ 的還原)
   • 說明：這是檸檬酸循環中的第二個氧化脫羧反應，再次釋放一分子 $\text{CO}_2$ 並產生一分子 $\text{NADH}$。

化療藥物透過多種機制殺死癌細胞，其原理通常是干擾癌細胞的生長和分裂，特別是針對快速增殖的細胞。然而，由於正常細胞中也有一些快速分裂的細胞（如骨髓細胞、毛囊細胞、消化道黏膜細胞），化療藥物也會對這些細胞造成傷害，這是化療常見的副作用。藥物的設計和應用會盡量尋求平衡，以最大化殺傷癌細胞並最小化對正常細胞的損害。

以下是針對阿黴素、順鉑、替莫唑胺的原理說明：

一、 阿黴素 (Doxorubicin)

• 原理：阿黴素屬於蒽環類抗生素（anthracycline antibiotic），主要通過以下機制殺死癌細胞：

  1. DNA 嵌入 (DNA intercalation)：阿黴素的平面結構可以嵌入 DNA 雙螺旋的鹼基對之間，干擾 DNA 的複製、轉錄和修復過程。
  2. 拓撲異構酶 II 抑制 (Topoisomerase II inhibition)：阿黴素會穩定拓撲異構酶 II（Topoisomerase II）與 DNA 的複合物，阻止 DNA 斷裂後的重新連接。這導致 DNA 產生大量的斷裂，最終觸發細胞凋亡（apoptosis）。
  3. 產生自由基 (Free radical generation)：阿黴素能夠被細胞內的還原酶還原，產生具有細胞毒性的自由基（如氧自由基）。這些自由基會損傷 DNA、蛋白質和細胞膜。

• 如何盡量避免正常細胞死亡：

  • 劑量控制：嚴格控制藥物劑量和給藥頻率，使藥物濃度在殺傷癌細胞的同時，盡量在正常細胞可耐受的範圍內。
  • 給藥途徑：靜脈注射，藥物在體內循環。
  • 副作用管理：通過支持性療法（如輸血、止吐藥、生長因子等）來幫助正常細胞恢復和減輕副作用。
  • 藥物代謝：阿黴素在肝臟代謝，其排泄途徑也影響其在不同組織的暴露時間。

二、 順鉑 (Cisplatin)

• 原理：順鉑是一種鉑類化合物，其主要作用機制是與 DNA 發生交聯（cross-linking），干擾 DNA 的結構和功能：

  1. DNA 鏈內和鏈間交聯：順鉑進入細胞後，其氯離子被水分子取代，形成帶正電的絡合物。這個絡合物會與 DNA 中的鳥嘌呤（Guanine, G）等鹼基結合，形成鏈內（intra-strand）或鏈間（inter-strand）的 DNA 交聯。
  2. 干擾 DNA 複製和轉錄：這些 DNA 交聯會導致 DNA 結構扭曲，阻礙 DNA 聚合酶和 RNA 聚合酶的移動，從而抑制 DNA 的複製和 RNA 的轉錄。
  3. 觸發細胞凋亡：細胞通過 DNA 修復機制試圖修復這些損傷。如果損傷過於嚴重，DNA 修復系統無法有效修復，就會觸發細胞凋亡程序。

• 如何盡量避免正常細胞死亡：

  • 藥物結構設計：順鉑的結構使其對快速分裂的細胞（如癌細胞）的 DNA 損傷更為敏感。

表觀遺傳學 (Epigenetics)

表觀遺傳學是指研究不改變 DNA 序列本身，但能夠影響基因表達（即基因的打開或關閉）的可遺傳的變化。這些變化通常涉及 DNA 的化學修飾和組蛋白的修飾，這些修飾可以改變染色質的結構，從而影響基因的可及性（accessibility）和轉錄活性。

關鍵特徵：

1. 不改變 DNA 序列：與基因突變不同，表觀遺傳學的變化不涉及 DNA 鹼基序列的改變。
2. 影響基因表達：通過改變 DNA 或組蛋白的結構，來調節基因的開啟或關閉，從而影響蛋白質的合成。
3. 可遺傳性：這些表觀遺傳標記可以通過細胞分裂（有絲分裂）傳遞給子細胞，有時甚至可以通過生殖細胞（減數分裂）傳遞給下一代（跨代遺傳）。
4. 可逆性：與基因突變的不可逆性不同，許多表觀遺傳修飾是可逆的，可以受到環境因素的影響。

主要的表觀遺傳機制包括：

• DNA 甲基化 (DNA Methylation)：在哺乳動物中，主要是胞嘧啶（Cytosine, C）在 CpG 二核苷酸位點（CpG dinucleotides）上被甲基化（添加甲基 $-\text{CH}_3$）。通常，基因啟動子區域的 CpG 區域（CpG islands）如果被甲基化，會導致基因沉默（基因關閉）；而未甲基化則通常與基因表達活躍相關。
• 組蛋白修飾 (Histone Modification)：組蛋白是 DNA 纏繞形成核小體（nucleosome）的基本蛋白質。組蛋白的 N 端尾部可以發生多種化學修飾，如乙醯化（acetylation）、甲基化（methylation）、磷酸化（phosphorylation）、泛素化（ubiquitination）等。
  • 組蛋白乙醯化：通常與基因激活相關。乙醯化會降低組蛋白尾部的正電荷，使其與帶負電荷的 DNA 之間的結合減弱，從而使染色質結構鬆散，有利於轉錄因子接近 DNA，啟動基因表達。
  • 組蛋白甲基化：可以與基因激活或抑制相關，取決於甲基化的位點和數量。
• 非編碼 RNA (Non-coding RNA)：一些非編碼 RNA（如 microRNAs, miRNAs 和長鏈非編碼 RNA, lncRNAs）也可以通過與 DNA、RNA 或蛋白質結合，調控基因表達。

在真核生物中表現表觀遺傳學的例子：

1. 細胞分化 (Cell Differentiation)：
   • 說明：一個受精卵（合子）通過一系列的細胞分裂和分化，發育成擁有數萬億個細胞的複雜多細胞生物。儘管所有體細胞都擁有相同的基因組（DNA 序列），但它們卻能分化成具有不同結構和功能的細胞類型，如神經細胞、肌肉細胞、肝細胞等。
   • 表觀遺傳學的作用：細胞分化過程中，特定的基因會被選擇性地開啟或關閉。

基因轉錄（Transcription）和轉譯（Translation）是基因表達的兩個核心過程，它們共同將 DNA 中的遺傳信息轉化為具有特定功能的蛋白質分子。

一、 基因轉錄 (Transcription)

基因轉錄是將 DNA 序列中的遺傳信息複製到信使 RNA（mRNA）分子中的過程。這個過程主要由 RNA 聚合酶（RNA polymerase）催化，並涉及啟動子（promoter）、終止子（terminator）等 DNA 序列的識別。

過程步驟：

1. 起始 (Initiation)：

   • RNA 聚合酶的識別：RNA 聚合酶（在真核生物中有多種類型，如 Pol I, Pol II, Pol III）會識別 DNA 上的啟動子區域。
   • 形成轉錄複合物：在細菌中，RNA 聚合酶的 $\sigma$ 因子幫助識別啟動子；在真核生物中，需要多種轉錄因子 (Transcription Factors, TFs)（包括通用轉錄因子 General TFs 和特異性轉錄因子 Specific TFs）與啟動子結合，並招募 RNA 聚合酶 II 形成一個轉錄起始複合物 (Transcription Initiation Complex, TIC)。
   • 解開 DNA 雙螺旋：RNA 聚合酶在啟動子區域解開 DNA 雙螺旋，暴露出模板鏈。

2. 延伸 (Elongation)：

   • RNA 合成：RNA 聚合酶沿著 DNA 模板鏈，以 3' 到 5' 的方向移動，按照鹼基互補配對原則（A-U, T-A, C-G, G-C），將核糖核苷酸（ATP, UTP, CTP, GTP）逐一添加到新合成的 RNA 鏈的 3' 末端，形成一個 RNA 分子。RNA 合成方向是 5' 到 3'。
   • DNA 雙螺旋的動態變化：RNA 聚合酶在移動過程中，不斷解開前方的 DNA 雙螺旋，並在後方重新連接。

3. 終止 (Termination)：

   • 識別終止信號：RNA 聚合酶遇到 DNA 上的終止子序列。
   • RNA 分子的釋放：根據不同的終止機制（細菌有 Rho-dependent 和 Rho-independent 兩種；真核生物機制更複雜），RNA 聚合酶會脫離 DNA 模板，釋放出新合成的 RNA 分子。

轉錄後修飾 (Post-transcriptional Modification) - 真核生物：
在真核生物中，新合成的初級轉錄本（pre-mRNA）需要經過進一步的修飾才能成為成熟的 mRNA，進入細胞質參與轉譯：

• 5' 端加帽 (5' capping)：在 mRNA 的 5' 末端添加一個特殊的結構（7-甲基鳥苷酸，m7Gppp），這有助於 mRNA 的穩定、核輸出以及與核糖體結合。
• 3' 端加尾 (3' polyadenylation)：在 mRNA 的 3' 末端添加一長串的腺嘌呤核苷酸（Poly-A tail），這有助於 mRNA 的穩定、核輸出以及轉譯效率。
• 剪接 (Splicing)：去除內含子（introns，非編碼區）並連接外顯子（exons，編碼區）的過程。這個過程由稱為剪接體（spliceosome）的複合物完成。

二、 基因轉譯 (Translation)

基因轉譯是將 mRNA 分子中的核苷酸序列信息轉化為蛋白質氨基酸序列的過程。這個過程發生在細胞質的核糖體（ribosome）上，需要轉運 RNA（tRNA）攜帶特定的氨基酸，並遵循遺傳密碼（genetic code）進行。

過程步驟：

1. 起始 (Initiation)：

   • 核糖體結合：成熟的 mRNA 分子攜帶遺傳信息進入細胞質。在細菌中，mRNA 的 Shine-Dalgarno 序列與核糖體的小亞基結合；在真核生物中，mRNA 的 5' 帽結構幫助其與核糖體小亞基結合，然後沿著 mRNA 移動尋找起始密碼子（AUG）。
   • 起始 tRNA 的結合：攜帶第一個氨基酸（通常是甲硫氨酸 Met，或在細菌中是 N-甲醯甲硫氨酸 fMet）的起始 tRNA 結合到起始密碼子 AUG 上。
   • 核糖體大亞基結合：大亞基結合到小亞基上，形成一個完整的起始複合物，起始 tRNA 位於 P 位點（peptidyl site）。

2. 延伸 (Elongation)：

   • 第二個氨基酸的攜帶：帶有下一個氨基酸的 tRNA 分子，其反密碼子（anticodon）與 mRNA 上的相鄰密碼子（A 位點, aminoacyl site）互補配對。

核心觀念

本題評量對細胞色素 P450 酵素系統（Cytochrome P450 enzymes, 簡稱 CYP450）的結構特徵、催化機制、亞細胞定位及生化反應式的掌握程度。核心考核點包含：

1. CYP450 之結構與命名原理：血基質（Heme-thiolate）活性中心與其在還原態結合 $\text{CO}$ 時於 $450\text{ nm}$ 的特徵吸收峰。
2. 酵素分類與催化特性：屬於單加氧酶（Monooxygenase）／混合功能氧化酶（Mixed-function oxidase），利用還原當量（$\text{NADPH}$）與分子氧（$\text{O}_2$）進行氧化修飾。
3. 真核生物中之次細胞分佈與電子傳遞鏈：微粒體（內質網）與粒線體兩大系統之輔助電子傳遞蛋白。
4. 代表性生化反應式：單加氧反應之總反應化學計量式（Stoichiometry）與內源性／外源性代謝實例。

解題方法

申論題（佔分 15%）之答題架構應條理分明，建議拆解為兩大部分進行系統性論述：

1. CYP450 之特點：從「結構與命名」、「催化本質與反應類型」、「亞細胞定位與電子傳遞系統」、「生理與藥物代謝功能」四大構面完整切入。
2. 真核生物體內生化作用之代表性方程式：先寫出通用的「單加氧反應總方程式（General equation for monooxygenation）」，確保原子與電子完全平衡；再列舉真核生物體內具代表性的「內源性合成（如類固醇荷爾蒙合成）」與「外源性代謝（第一相反應羥基化）」實例方程式。

申論詳解

一、Cytochrome P450 (CYP450) 之特點

1. 結構特徵與命名由來（Structure & Spectral Characteristics）：

   • CYP450 是一群含有**原血紅素 IX（Protoporphyrin IX / Heme $b$）**的血基質硫醇鹽蛋白超家族（Heme-thiolate protein superfamily）。
   • 其活性中心的 $\text{Fe}^{3+}/\text{Fe}^{2+}$ 鐵離子，第五個配位基（Axial ligand）為蛋白質骨架上保守的半胱胺酸殘基（Cysteine）之硫醇基（$-\text{S}^-$）。
   • 當血基質鐵處於還原態（$\text{Fe}^{2+}$）並與一氧化碳（$\text{CO}$）結合時，在紫外-可見光光譜（Soret band）會出現特徵性的最大吸收波長 $450\text{ nm}$，此為「P450（Pigment 450）」名稱之由來。

2. 酵素催化類型（Enzymatic Classification）：

   • 屬於單加氧酶（Monooxygenase），舊稱混合功能氧化酶（Mixed-function oxidase）。
   • 催化反應時會活化一分子氧氣（$\text{O}_2$），將其中一個氧原子嵌入受質分子（$\text{R-H}$）中生成羥基化合物（$\text{R-OH}$），另一個氧原子則接受電子與質子還原成水分子（$\text{H}_2\text{O}$）。

3. 真核生物細胞定位與電子傳遞系統（Subcellular Localization & Electron Transfer）：
   真核生物（如哺乳類動物細胞）中的 CYP450 均為膜結合蛋白（Membrane-bound proteins），主要分佈於兩個胞器：

   • 內質網膜（Endoplasmic Reticulum, ER / 微粒體 Microsomal 系統）：
     • 電子傳遞途徑：$\text{NADPH} \rightarrow \text{NADPH-CYP450 還原酶（CPR，含 FAD 與 FMN 之雙黃素蛋白）} \rightarrow \text{CYP450}$。
     • 主導外源異生物質（Xenobiotics，如藥物、環境毒素）之代謝，以及脂肪酸與前列腺素之合成。
   • 粒線體內膜（Mitochondrial inner membrane 系統）：
     • 電子傳遞途徑：$\text{NADPH} \rightarrow \text{腎上腺皮質素還原酶（Adrenodoxin reductase，含 FAD）} \rightarrow \text{腎上腺皮質素（Adrenodoxin, [2Fe-2S] 鐵硫蛋白）} \rightarrow \text{CYP450}$。
     • 專一性參與類固醇荷爾蒙、膽汁酸（Bile acids）及活性維生素 D 之生合成。

4. 廣泛的受質特異性與臨床功能（Functional Diversity & Clinical Relevance）：

   • 外源物第一相代謝（Phase I Metabolism）：透過羥基化（Hydroxylation）、脫烷基化（Dealkylation）、環氧化（Epoxidation）等增加分子極性與水溶性，促進腎臟或膽汁排泄（主要亞型：CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9 等）。
   • 內源性生化修飾：參與膽固醇生合成（如羊毛脂醇轉化）、類固醇轉化（皮質醇、醛固酮、性荷爾蒙）、維生素 $\text{D}_3$ 活化（如 $1\alpha$-羥基化）。
   • 酵素誘導（Induction）與抑制（Inhibition）：受特定藥物或受質影響時表現量或活性會劇烈改變，是臨床藥物交互作用（DDI）與個別化醫療（基因多型性）的核心機制。