114 年 國立成功大學臨床藥學與藥物科技研究所乙組《生物化學》

緩衝溶液的原理是利用弱酸及其共軛鹼（或弱鹼及其共軛酸）來維持溶液 $pH$ 的穩定。多質子酸（如 $H_3PO_4$）有多個質子可以解離，每個質子解離都有一個對應的 $pKa$ 值。當外加強酸或強鹼時，緩衝對中的弱酸或弱鹼會與之反應，吸收其對 $pH$ 的衝擊。
一個緩衝系統要能有效作用，其 $pH$ 值必須接近其緩衝對的 $pKa$ 值，這是因為當 $pH = pKa$ 時，弱酸和其共軛鹼的濃度相等，此時緩衝能力最強。

緩衝溶液的主要功能是抵抗外來酸或鹼的加入所引起的 $pH$ 值劇烈變化，從而維持溶液 $pH$ 的相對穩定。
選項 (A) 錯，緩衝溶液的 $pH$ 值取決於其緩衝對的 $pKa$ 值和比例，不一定是 7。

離子交換層析（Ion Exchange Chromatography, IEC）是一種根據蛋白質表面所帶電荷差異來分離蛋白質的方法。層析柱中填充有帶電的固定相（離子交換樹脂），例如陽離子交換劑（帶負電，吸附帶正電的分子）或陰離子交換劑（帶正電，吸附帶負電的分子）。
當蛋白質溶液通過離子交換柱時，帶相反電荷的蛋白質會與固定相發生靜電吸附，而帶相同電荷或不帶電的蛋白質則不會被吸附或吸附力很弱，隨流動相流出。

這題考驗對酶（酵素）基本性質的理解。
選項 (A) 正確。酶作為催化劑，只能改變反應的速率，而不能改變反應的平衡點，因此不能改變反應的整體自由能變化 ($\Delta G$)。反應的自發性由 $\Delta G$ 決定，酶無法使非自發反應變得自發。
選項 (B) 正確。

本題考驗 ABO 血型系統的知識。
人類的 ABO 血型系統主要由紅血球表面的 A 抗原和 B 抗原決定。

• A 型血：紅血球表面有 A 抗原，血清中有抗 B 抗體。
• B 型血：紅血球表面有 B 抗原，血清中有抗 A 抗體。
• AB 型血：紅血球表面同時有 A 和 B 抗原，血清中無抗 A 或抗 B 抗體。
• O 型血：紅血球表面無 A 和 B 抗原，血清中有抗 A 和抗 B 抗體。

捐血原則：接受者體內不會產生抗體攻擊捐贈者的紅血球。

• O 型血是萬能捐血者（對紅血球而言），因為其紅血球無 A、B 抗原。
• AB 型血是萬能受血者，因為其血清無抗 A、B 抗體。

選項 (A) 正確。A 型血的紅血球有 A 抗原，可以捐給有 A 抗原（A 型）或同時有 A 和 B 抗原（AB 型）的人。AB 型血的人沒有抗 A 或抗 B 抗體，因此可以接受 A 型血的捐贈。
選項 (B) 錯誤。

本題考查核酸的基本組成單元。DNA（去氧核糖核酸）和 RNA（核糖核酸）的結構差異之一在於它們所含的五碳糖。

• DNA 的五碳糖是去氧核糖（deoxyribose）。在 2' 位置上，去氧核糖缺少一個氧原子，因此稱為「去氧」。
• RNA 的五碳糖是核糖（ribose）。核糖在 2' 位置上帶有一個羥基（-OH）。

凝膠電泳（Gel Electrophoresis）是一種根據分子大小和電荷來分離核酸（DNA 或 RNA）或蛋白質的技術。在核酸電泳（通常是瓊脂糖凝膠電泳）中，樣品被置於凝膠的一端，施加電場，帶負電的核酸分子會向正極移動。
凝膠的孔隙度會阻礙分子的移動。

微胞（Micelle）是在水溶液中，由具有兩親性（amphipathic）分子（如脂肪酸、磷脂質）自發形成的聚集體。兩親性分子一端是親水的（例如帶電的羧酸基團），另一端是疏水的（例如長碳氫鏈）。
在水中，為了最大程度地減少疏水部分與水的接觸，同時最大程度地增加親水部分與水的接觸，這些分子會形成球狀結構。

• 親水頭部（例如脂肪酸的羧酸基團 $COO^-$）會朝向周圍的水（溶劑），以與水分子形成氫鍵或離子-偶極相互作用。

必需胺基酸（Essential amino acids）和非必需胺基酸（Non-essential amino acids）的分類是基於生物體自身合成這些胺基酸的能力。

分類標準：
生物體內，胺基酸的分類主要依據其是否能由生物體自行從其他代謝前驅物合成。

必需胺基酸 (Essential Amino Acids)：
必需胺基酸是指人體或其他生物體無法自行從簡單的前驅物合成，或者合成速率遠低於生理需求的胺基酸，因此必須通過飲食攝取才能獲得。人體有九種必需胺基酸：

1. 離胺酸 (Lysine, Lys)
2. 白胺酸 (Leucine, Leu)
3. 異白胺酸 (Isoleucine, Ile)
4. 甲硫胺酸 (Methionine, Met)
5. 苯丙胺酸 (Phenylalanine, Phe)
6. 蘇胺酸 (Threonine, Thr)
7. 色胺酸 (Tryptophan, Trp)
8. 組胺酸 (Histidine, His)
9. 纈胺酸 (Valine, Val)
   （對於嬰兒，精胺酸 (Arginine, Arg) 也可能被視為必需胺基酸，因為其合成能力不足。）

非必需胺基酸 (Non-Essential Amino Acids)：

此題主要考查「相似相溶」原理，即極性分子傾向於溶解於極性溶劑，而非極性分子傾向於溶解於非極性溶劑。

1. 葡萄糖和蔗糖的極性：

• 葡萄糖 ($C_6H_{12}O_6$) 是一種單醣，其結構中含有多個羥基（-OH）和一個羰基（C=O）。
• **蔗糖 ($C_{12}H_{22}O_{11}$) ** 是一種雙醣，由葡萄糖和果糖組成，其結構中也含有大量的羥基。
• 這些羥基（-OH）是極性基團，能夠與水分子形成氫鍵。羰基（C=O）也是一個極性基團。
• 由於分子中存在大量的極性羥基，使得葡萄糖和蔗糖整體呈現出高度的極性。

2. 水的極性：

• 水分子 ($H_2O$) 是一個極性分子，氧原子帶部分負電荷，氫原子帶部分正電荷。
• 水分子能夠與葡萄糖和蔗糖的極性基團（特別是羥基）形成強的氫鍵。
• 溶解過程： 當葡萄糖或蔗糖加入水中時，水分子會包圍（水合）這些極性分子，並與其上的羥基形成氫鍵，將其從固體晶格中拉開，從而使其溶解。

3. 環己烷和苯的非極性：

• **環己烷 ($C_6H_{12}$) ** 是一種環狀烷烴，其結構主要由碳-碳單鍵和碳-氫單鍵構成。碳-碳鍵是非極性的，而碳-氫鍵的極性非常弱，且分子對稱性高，整體呈現高度的非極性。

蛋白質的結構層次是理解其功能基礎的關鍵。一級結構和二級結構是構成蛋白質三維結構的兩個重要基礎層次。

1. 蛋白質一級結構 (Primary Structure)：

• 定義： 蛋白質的一級結構是指構成蛋白質的胺基酸殘基所構成的線性序列。它描述了胺基酸是如何通過肽鍵（peptide bond）連接起來的。
• 鍵的類型： 胺基酸之間通過共價的肽鍵連接。肽鍵是由一個胺基酸的羧基（-COOH）與另一個胺基酸的胺基（-$NH_2$）脫水縮合形成的（-CO-NH-）。
• 信息來源： 蛋白質的一級結構由對應的基因（DNA序列）決定。基因序列決定了 mRNA 的序列，進而決定了蛋白質的胺基酸序列。
• 重要性： 一級結構是蛋白質三維結構的基礎。任何一級結構的改變（例如一個胺基酸的突變）都可能影響蛋白質的二級、三級甚至四級結構，進而影響其功能。例如，鐮刀型紅血球貧血症就是由於血紅素 β 鏈上一個胺基酸（谷胺酸被纈胺酸取代）的改變所致。
• 表示方法： 通常用胺基酸的單字母或三字母縮寫連成的序列來表示，例如 N-端到 C-端的序列：Met-Ala-Pro-Gly-Ser-...

2. 蛋白質二級結構 (Secondary Structure)：

• 定義： 蛋白質的二級結構是指由於肽鏈中胺基酸殘基的側鏈（R基）之間或肽鏈主鏈原子之間，通過非共價鍵（主要是氫鍵）形成的局部規則空間排列。

此題包含兩個主要部分：一、血糖調控胰島素分泌的分子機制；二、生酮飲食減重的生化機制。

第一部分：血糖調控胰島素分泌的分子機制

胰島素是由胰臟的 β 細胞分泌的一種重要的代謝激素，主要作用是降低血糖。其分泌受到血糖濃度的直接調控。

分子機制步驟：

1. 葡萄糖進入 β 細胞： 當血糖濃度升高時，葡萄糖分子通過葡萄糖轉運蛋白（GLUT2，在 β 細胞中是高 $K_m$ 的轉運蛋白，對血糖濃度變化敏感）進入 β 細胞。
2. 葡萄糖代謝與 ATP 產生： 進入 β 細胞的葡萄糖在細胞內經過糖解作用（glycolysis）和三羧酸循環（TCA cycle）的氧化代謝，產生大量的 ATP。
3. ATP 依賴性鉀離子通道關閉： 產生的 ATP 濃度升高，會與細胞膜上的 ATP 依賴性鉀離子通道（$K_{ATP}$ channel）結合。ATP 與通道的結合會導致該通道構象改變而關閉。
4. 細胞膜去極化： 鉀離子通道關閉後，鉀離子（$K^+$）外流受阻，導致細胞內正電荷累積，細胞膜內外電位差減小，即細胞膜發生去極化（depolarization）。
5. 電壓依賴性鈣離子通道打開： 細胞膜去極化會觸發細胞膜上的電壓依賴性鈣離子通道（voltage-gated calcium channels, VGCCs）打開。
6. 鈣離子內流： 細胞外高濃度的鈣離子（$Ca^{2+}$）通過打開的鈣離子通道內流到 β 細胞內。
7. 胰島素釋放： 細胞內鈣離子濃度的升高是觸發胰島素分泌的關鍵信號。鈣離子與細胞質中的囊泡（ يحتوي 胰島素）上的蛋白質（如突觸蛋白 synaptotagmin）相互作用，促進囊泡與細胞膜融合，將儲存的胰島素釋放到細胞外，進入血液循環。

總結： 高血糖 → 葡萄糖進入 β 細胞 → ATP 升高 → $K_{ATP}$ 通道關閉 → 細胞膜去極化 → $Ca^{2+}$ 通道打開 → $Ca^{2+}$ 內流 → 胰島素分泌。

第二部分：生酮飲食減重的生化機制

生酮飲食（Ketogenic Diet）是一種高脂肪、適量蛋白質、極低碳水化合物的飲食模式。其核心機制是誘導身體進入「酮症」（ketosis）狀態，轉而利用脂肪作為主要的能量來源。

從醣類與脂質代謝角度解釋減重生化機制：

1. 碳水化合物攝取極低 → 葡萄糖供應減少：
   • 飲食中碳水化合物攝取量極低，導致血液葡萄糖水平下降，肝臟和肌肉中的肝醣（glycogen）儲存耗竭。
   • 身體的主要能量來源從葡萄糖轉向脂肪。

此題要求闡述粒線體的 ATP 生成機制、電子傳遞鏈的作用，以及粒線體與氧化壓力的關係及相關疾病。

第一部分：粒線體 ATP 產生的生化機制及電子傳遞鏈的關聯性

粒線體是細胞的「能量工廠」，主要通過氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）過程產生 ATP。這個過程分為兩個主要階段：電子傳遞鏈（Electron Transport Chain, ETC）和化學滲透（Chemiosmosis）。

1. 電子傳遞鏈 (ETC)：

• 位置： 發生在粒線體內膜（inner mitochondrial membrane）。
• 組成： 包含一系列蛋白質複合物（Complex I-IV）和兩個移動性電子載體（泛醌 Q 和細胞色素 c）。
• 電子來源： 主要來自細胞質和粒線體基質中的代謝過程（如糖解、丙酮酸氧化、脂肪酸 β-氧化、三羧酸循環）產生的還原性電子載體 NADH 和 $FADH_2$。
• 過程：
  • NADH 在 Complex I 處氧化，釋放電子，NADH 變為 $NAD^+$。
  • $FADH_2$ 在 Complex II 處氧化，釋放電子，$FADH_2$ 變為 FAD。
  • 電子從 Complex I 或 II 傳遞給泛醌 Q，然後傳遞給 Complex III。
  • 電子從 Complex III 傳遞給細胞色素 c，然後傳遞給 Complex IV。
  • 在 Complex IV 處，電子最終傳遞給分子氧 ($O_2$)，氧接受電子並與質子（$H^+$）結合，生成水 ($H_2O$)。這是 ETC 的終端電子受體。
• 質子泵浦： 在電子傳遞過程中，Complex I, III, 和 IV 會利用電子傳遞釋放的能量，將質子（$H^+$）從粒線體基質（matrix）泵浦到粒線體膜間隙（intermembrane space）。

2. 化學滲透 (Chemiosmosis)：

• 質子梯度： 質子泵浦作用導致粒線體膜間隙的質子濃度（$H^+$）遠高於基質，形成一個質子濃度梯度和電位梯度，這是一個質子驅動勢（proton motive force）。
• ATP 合成酶 (ATP Synthase)： 質子驅動勢驅動質子通過位於粒線體內膜上的 ATP 合成酶（也稱為 Complex V）。
• ATP 產生： 當質子流經 ATP 合成酶時，該酶的構象發生改變，利用質子流動的能量，將 ADP 和無機磷酸（$P_i$）合成 ATP。這個過程稱為化學滲透磷酸化。

關聯性總結：
電子傳遞鏈的關鍵作用是將 NADH 和 $FADH_2$ 中的高能電子傳遞給氧，釋放能量。這些能量被用於泵浦質子，建立膜間隙的質子梯度。而這個質子梯度，即化學滲透勢，是驅動 ATP 合成酶合成 ATP 的能量來源。因此，電子傳遞鏈是 ATP 合成（氧化磷酸化）的能量獲取階段，化學滲透則是 ATP 的實際合成階段，兩者緊密相關，共同完成粒線體主要的 ATP 生產。

第二部分：粒線體與氧化壓力相關的疾病機制

氧化壓力（Oxidative Stress）是指細胞內活性氧物種（Reactive Oxygen Species, ROS）的產生與抗氧化能力之間失衡的狀態，導致細胞損傷。粒線體在氧化壓力的產生和調節中扮演著核心角色。

1. 粒線體產生 ROS：

• 電子傳遞鏈的副反應： 在電子傳遞鏈的過程中，尤其是在 Complex I 和 Complex III 處，部分電子可能會逃逸，與分子氧直接反應，形成超氧陰離子自由基 (

此題包含三個部分：SDS-PAGE 的原理與應用；Western Blot 的蛋白質鑑定；以及質譜分析的蛋白質鑑定，並要求比較後兩者。

第一部分：蛋白質電泳技術 (SDS-PAGE) 的原理與應用

原理：
SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一種廣泛用於分離蛋白質的技術，其原理是利用蛋白質的電泳遷移率差異，主要基於蛋白質的分子量。

1. SDS 的作用： 陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）與蛋白質結合。SDS 是一種離子型去污劑，它能：
   • 破壞蛋白質的非共價鍵（包括疏水相互作用和離子鍵），使蛋白質變性（denature）成線性的多肽鏈。
   • 在蛋白質表面均勻地覆蓋一層負電荷，使蛋白質的電荷與其大小（長度）的比例大致相同，即每約 2 個胺基酸殘基結合 1 個 SDS 分子，提供約 -1 的淨電荷。
2. 電泳： 將變性並帶有均勻負電荷的蛋白質樣品置於聚丙烯醯胺凝膠（polyacrylamide gel）的一端，施加電場。
3. 分離： 蛋白質分子帶負電荷，向正極（陽極）移動。凝膠的孔隙度對蛋白質的遷移起到了篩選作用。較小的蛋白質分子更容易穿過凝膠的孔隙，移動速度快；較大的蛋白質分子則移動緩慢。
4. 結果： 根據蛋白質的分子量大小，它們在凝膠上分離成不同的條帶。通常會使用已知分子量的蛋白質標準品（marker）作為參照，來估計未知蛋白質的分子量。

應用：

• 蛋白質分子量測定： 最主要的應用是估計蛋白質的分子量。
• 蛋白質純度評估： 通過觀察樣品中蛋白質條帶的數量和清晰度，可以初步判斷蛋白質的純度。
• 比較樣品中蛋白質的表達水平： 在定量 SDS-PAGE 中，可以比較不同樣品中同一蛋白質條帶的強度，以評估其相對表達水平。
• 為後續分析做準備： SDS-PAGE 可以作為蛋白質印跡（Western Blot）或質譜分析的前處理步驟，將蛋白質分離並變性，便於後續的檢測。

第二部分：Western Blot 與質譜分析在蛋白質鑑定中的異同比較

Western Blot (蛋白質印跡)：

• 原理： 結合 SDS-PAGE 的蛋白質分離能力和免疫學檢測方法。
  1. 首先通過 SDS-PAGE 將蛋白質分離。
  2. 然後將凝膠上的蛋白質轉移（blotting）到一個固體載體（如硝酸纖維素膜或 PVDF 膜）上，使蛋白質能穩定結合，便於後續操作。
  3. 使用特異性的抗體（primary antibody）來識別和結合目標蛋白質。
  4. 再使用標記有酶或螢光物的第二抗體（secondary antibody，識別第一抗體）進行信號放大和檢測，通過顯色、發光或螢光反應來顯示目標蛋白質條帶的位置和強度。
• 鑑定能力： 主要基於抗體的特異性。能夠精確鑑定已知蛋白質，因為需要針對該蛋白質的特定抗體。
• 優點： 特異性高，靈敏度相對較高，可以進行半定量分析。
• 缺點： 需要預先知道目標蛋白質的抗體；抗體的質量和特異性至關重要；無法識別未知蛋白質或發現新的蛋白質變異體。

質譜分析 (Mass Spectrometry, MS)：

• 原理： 測量分子離子的質荷比（m/z）。
  1. 蛋白質樣品（通常是經過酶解，如胰蛋白酶酶解成肽段）被導入質譜儀。
  2. 通過電離方法（如 ESI, MALDI）將蛋白質或肽段轉化為離子。
  3. 質譜儀根據離子的質荷比（m/z）來檢測和量化它們。
  4. 通過比較樣品中肽段的質荷比數據與蛋白質數據庫中的理論值，來推斷樣品中存在的蛋白質。
• 鑑定能力： 能夠鑑定未知蛋白質。