113 年 國立成功大學臨床藥學與藥物科技研究所乙組《生物化學》

此題考查酮體代謝的觀念。酮體是脂肪酸代謝的產物，在特定生理條件下，如長期飢餓或糖尿病時，肝臟會大量產生酮體作為替代能源。

1. 酮體 (Ketone bodies) 的定義
酮體是指由肝臟合成的一組水溶性分子，主要包括乙醯乙酸 (acetoacetate)、β-羥丁酸 (β-hydroxybutyrate) 和丙酮 (acetone)。它們是脂肪酸氧化分解的副產物。

2. 酮體的產生 (Ketogenesis)
酮體的產生主要發生在肝臟的粒線體中，其過程如下：

• 脂肪酸活化: 肝臟細胞中的游離脂肪酸 (free fatty acids, FFA) 被活化成醯基輔酶 A (acyl-CoA)。
• β-氧化: 活化的脂肪酸在粒線體中經過 β-氧化，產生大量的乙醯輔酶 A (acetyl-CoA)。
• 酮體合成: 當肝臟中的乙醯輔酶 A 累積過多，且細胞內的草醯乙酸 (oxaloacetate) 濃度不足（例如在碳水化合物攝取不足時，草醯乙酸用於糖質新生），無法進入檸檬酸循環 (citric acid cycle) 時，乙醯輔酶 A 就會進入酮體合成途徑。
  • 兩分子乙醯輔酶 A 縮合形成乙醯乙醯輔酶 A (acetoacetyl-CoA)。

此題考查從頭合成脂肪的生化途徑。De novo lipogenesis 是指利用非脂肪前驅物（主要是葡萄糖）合成脂肪的過程，是人體儲存能量的重要機制。

1. De novo lipogenesis (DNL) 的定義
De novo lipogenesis (DNL) 是指從頭合成脂肪的過程，即利用碳水化合物（主要是葡萄糖）代謝產生的乙醯輔酶 A (acetyl-CoA) 來合成脂肪酸，再與甘油結合形成三酸甘油酯 (triglycerides)。這個過程主要發生在肝臟、脂肪組織和乳腺。

2. De novo lipogenesis 的發生過程
DNL 主要分為兩個階段：

• 乙醯輔酶 A 的產生:
  • 葡萄糖進入細胞後，經過醣解作用 (glycolysis) 產生丙酮酸 (pyruvate)。
  • 丙酮酸進入粒線體，被丙酮酸脫氫酶複合物 (pyruvate dehydrogenase complex) 氧化脫羧，形成乙醯輔酶 A。
  • 然而，乙醯輔酶 A 無法直接通過粒線體膜。它需要與草醯乙酸 (oxaloacetate) 結合形成檸檬酸 (citrate)，然後檸檬酸運輸到細胞質。
  • 在細胞質中，檸檬酸裂解酶 (citrate lyase) 將檸檬酸分解為乙醯輔酶 A 和草醯乙酸。細胞質中的乙醯輔酶 A 是 DNL 的直接前驅物。
• 脂肪酸的合成:
  • 細胞質中的乙醯輔酶 A 在乙醯輔酶 A 羧化酶 (acetyl-CoA carboxylase, ACC) 的催化下，首先被羧化形成丙二醯輔酶 A (malonyl-CoA)。此為脂肪酸合成的限速步驟，需要生物素 (biotin) 和 ATP。

此題考查中心法則 (Central dogma) 中的基因表現，包含 DNA 轉錄成 RNA 和 RNA 轉譯成蛋白質的過程，以及相關的調控機制。

1. DNA 轉錄成 RNA (Transcription)
轉錄是將 DNA 序列的遺傳訊息複製到 RNA 分子中的過程。

• 階段:
  • 起始 (Initiation): RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 識別 DNA 上的啟動子 (promoter) 序列，結合並解開 DNA 雙股螺旋，開始合成 RNA。
  • 延長 (Elongation): RNA 聚合酶沿著 DNA 的模板鏈 (template strand) 移動，以 DNA 為模板，按照鹼基互補配對原則（A-U, T-A, C-G, G-C）合成一條 RNA 鏈。
  • 終止 (Termination): 當 RNA 聚合酶遇到 DNA 上的終止子 (terminator) 序列時，轉錄停止，合成的 RNA 分子從 DNA 和 RNA 聚合酶上釋放。
• RNA 種類:
  • mRNA (messenger RNA): 攜帶蛋白質的遺傳密碼，將在細胞質中被轉譯成蛋白質。
  • tRNA (transfer RNA): 在蛋白質合成中，負責攜帶特定胺基酸，並識別 mRNA 上的密碼子。
  • rRNA (ribosomal RNA): 是核糖體 (ribosome) 的組成部分，參與蛋白質的合成。
  • 其他 RNA: 如 snRNA, snoRNA, miRNA, siRNA 等，參與 RNA 加工、基因調控等。
• 真核生物的 RNA 加工 (RNA Processing): 在真核生物中，初級轉錄產物 (pre-mRNA) 需要經過加工才能形成成熟的 mRNA。包括：
  • 加帽 (Capping): 在 mRNA 的 5' 端加上一個特殊的鳥糞嘌呤核苷酸 (modified guanine nucleotide)。
  • 加尾 (Polyadenylation): 在 mRNA 的 3' 端加上一串腺嘌呤核苷酸 (poly-A tail)。
  • 剪接 (Splicing): 去除內含子 (introns)，將外顯子 (exons) 連接起來。

2. RNA 轉譯為蛋白質 (Translation)
轉譯是將 mRNA 上的遺傳密碼轉化為胺基酸序列，合成蛋白質的過程。主要在細胞質的核糖體上進行。

• 階段:
  • 起始 (Initiation): mRNA 的起始密碼子 (start codon, 通常是 AUG) 與核糖體的 P 位點結合。攜帶第一個胺基酸（真核生物是甲硫胺酸, methionine）的起始 tRNA 與起始密碼子結合。
  • 延長 (Elongation):
    • 攜帶下一個胺基酸的 tRNA，根據 mRNA 上的密碼子，進入核糖體的 A 位點 (aminoacyl site) 與 mRNA 結合。
    • 在核糖體催化下，P 位點上的胺基酸（或肽鏈）轉移到 A 位點的胺基酸上，形成肽鍵。
    • 核糖體沿著 mRNA 移動一個密碼子的距離（從 A 位點移到 P 位點，原 P 位點的 tRNA 移到 E 位點並釋放）。

此題考查當前熱門的基因編輯技術 CRISPR-Cas9 的原理、優缺點及應用。

1. CRISPR 基因編輯技術的原理
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是一種源自細菌和古細菌的適應性免疫系統。CRISPR-Cas9 系統是其中一種應用最廣泛的基因編輯工具。其原理是利用一個導向 RNA (guide RNA, gRNA) 來引導 Cas9 核酸酶（一種 DNA 剪切酶）到目標 DNA 序列進行切割。

• 組成:
  • Cas9 核酸酶: 負責切割雙股 DNA。
  • 導向 RNA (gRNA): 由兩部分組成：
    • crRNA (CRISPR RNA): 包含約 20 個鹼基的序列，與目標 DNA 序列互補，負責識別和結合目標 DNA。
    • tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA): 結合到 crRNA 上，並與 Cas9 形成複合物。在實驗室中，通常將 crRNA 和 tracrRNA 合併成一個單一的嵌合導向 RNA (single guide RNA, sgRNA)。
• 作用機制:
  1. 靶向: sgRNA 的 20 個鹼基序列與目標 DNA 序列進行鹼基配對。
  2. 結合: sgRNA-Cas9 複合物結合到目標 DNA 上。Cas9 酶需要 PAM (Protospacer Adjacent Motif) 序列（例如，對於 Cas9 來自 Streptococcus pyogenes，PAM 序列是 NGG）存在於目標 DNA 的下游，才能進行切割。PAM 序列是 Cas9 識別並結合 DNA 的必要條件，但它本身不與 sgRNA 配對。
  3. 切割: 當 sgRNA 與目標 DNA 序列完全配對，且 PAM 序列正確存在時，Cas9 酶會切割雙股 DNA，在目標位點產生雙股斷裂 (double-strand break, DSB)。
  4. 修復: 細胞自身的 DNA 修復機制會嘗試修復這個雙股斷裂。
     • 非同源末端連接 (Non-homologous end joining, NHEJ): 這是一種容易出錯的修復途徑，常在斷裂處引入小的插入或缺失 (insertions or deletions, indels)，導致移碼突變 (frameshift mutation)，從而使目標基因失活（基因敲除, gene knockout）。
     • 同源定向修復 (Homology-directed repair, HDR): 如果在切割位點附近提供一個帶有同源序列的 DNA 修復模板，細胞就可以利用這個模板來精確修復斷裂，從而實現基因的精確編輯，例如插入新的基因序列或修正突變。

此題考查聚合酶連鎖反應 (PCR) 的核心原理和操作步驟，這是一種體外擴增特定 DNA 片段的強大技術。

1. PCR 的原理
PCR 的基本原理是利用 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 在體外模擬細胞內的 DNA 複製過程，對目標 DNA 序列進行指數級的擴增。其核心在於利用一對寡核苷酸引物 (oligonucleotide primers)，它們能夠特異性地結合到目標 DNA 序列的兩端，並為 DNA 聚合酶提供一個起始點，從而僅擴增引物之間區域的 DNA。

2. PCR 的過程
PCR 是一個週期性的反應，每個週期包含三個基本步驟，通常在熱循環儀 (thermocycler) 中進行，通過精確控制溫度和時間來完成。一個典型的 PCR 循環包括：

• 變性 (Denaturation):
  • 溫度: 約 94-98°C。
  • 目的: 加熱使雙股 DNA 分子中的氫鍵斷裂，分離成兩條單鏈 DNA。這是為引物結合和 DNA 聚合酶作用提供模板。
• 退火 (Annealing):
  • 溫度: 約 50-65°C（根據引物的長度和序列決定）。
  • 目的: 降低溫度，使互補的引物能夠特異性地結合到變性後的單鏈 DNA 模板的互補區域上。一對引物（正向引物和反向引物）分別結合到目標 DNA 區域的兩端。
• 延伸 (Extension/Elongation):