109 年 國立臺灣大學農業化學系碩士班乙組《微生物學（A）》

Gram 染色法是鑑別細菌的重要方法，其結果與細胞壁的結構密切相關。革蘭氏陽性菌（Gram-positive bacteria）與革蘭氏陰性菌（Gram-negative bacteria）在細胞壁結構上的主要差異如下：

1. 肽聚醣層 (Peptidoglycan layer)：

   • 革蘭氏陽性菌：擁有一個非常厚（約 20-80 nm）的肽聚醣層，佔細胞壁總厚度的 60-90%。此層結構緻密，是革蘭氏陽性菌在染色過程中能保留結晶紫染色的關鍵。
   • 革蘭氏陰性菌：肽聚醣層相對較薄（約 5-10 nm），僅佔細胞壁總厚度的 10% 左右。

2. 外膜 (Outer membrane)：

   • 革蘭氏陽性菌：沒有外膜。其細胞壁結構主要由厚肽聚醣層組成，其外側可能附有 teichoic acids 和 lipoteichoic acids。
   • 革蘭氏陰性菌：擁有一層外膜，位於肽聚醣層之外。外膜由磷脂質、脂多醣（Lipopolysaccharide, LPS）和蛋白質組成。LPS 是革蘭氏陰性菌的特徵，其脂質 A 部分具有內毒素活性，而 O 抗原則具有高度變異性。外膜的親脂性結構對許多抗生素和消毒劑具有抵抗力。

3. 周質空間 (Periplasmic space)：

   • 革蘭氏陽性菌：周質空間通常很小，或幾乎不存在。
   • 革蘭氏陰性菌：擁有一個明顯的周質空間，位於內膜（質膜）和外膜之間。這個空間內含有肽聚醣層，以及多種水解酶和運輸蛋白。

Gram 染色法是微生物學中一種基本的鑑別染色技術，其步驟與所使用的試劑順序至關重要。此法的原理是利用細菌細胞壁對脫色劑（如酒精）的抵抗力不同來區分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。正確的步驟和試劑順序如下：

1. 初染 (Primary stain)：使用結晶紫（Crystal violet, D）作為初染劑，它能穿透所有細菌細胞，使其呈現紫色。
2. 媒染 (Mordant)：加入碘液（Iodine, E）。碘會與結晶紫形成複合物（結晶紫-碘複合物），這個複合物在革蘭氏陽性菌厚肽聚醣層中不易被脫去，而在革蘭氏陰性菌中則相對容易被脫去。
3. 脫色 (Decolorization)：使用酒精（Alcohol, A）或酒精-丙酮混合物進行脫色。革蘭氏陽性菌的厚肽聚醣層能抵抗酒精的脫色作用，保持紫色；

主動運輸 (Active transport) 是一種將物質逆濃度梯度跨膜運輸的過程，需要消耗能量。根據能量來源的不同，主動運輸可分為「初級主動運輸」(Primary active transport) 和「次級主動運輸」(Secondary active transport)。

初級主動運輸 (Primary Active Transport)：

• 能量來源：直接利用化學能，通常是 ATP 的水解，來驅動物質的運輸。
• 機制：涉及膜上的蛋白質（通常是 ATPases 或 P-type ATPases），這些蛋白質直接結合 ATP，並利用 ATP 水解釋放的能量來改變構象，將底物從低濃度一側泵送至高濃度一側。
• 例子：
  • 鈉鉀幫浦 (Na+/K+-ATPase)：在動物細胞中，將 3 個 Na+ 離子泵出細胞，同時將 2 個 K+ 離子泵入細胞，維持細胞內外的離子濃度梯度，消耗大量 ATP。
  • 鈣離子幫浦 (Ca2+-ATPase)：將 Ca2+ 離子泵出細胞質，維持細胞質中 Ca2+ 濃度極低。
  • 質子幫浦 (H+-ATPase)：在許多細菌和真核細胞中，將 H+ 離子泵出細胞，產生質子梯度。

次級主動運輸 (Secondary Active Transport)：

• 能量來源：不直接利用 ATP 水解，而是利用另一種物質的電化學梯度能（通常是 Na+ 或 H+ 梯度）來驅動物質的運輸。這個梯度能本身是通過初級主動運輸（如質子幫浦）建立和維持的。
• 機制：涉及攜帶蛋白（symporters 或 antiporters）。
  • 同向運輸 (Symport)：兩種物質同時向同一方向運輸。

核心觀念

本題比較細菌與古菌的細胞壁、核糖體、染色體、莢膜／黏液層及外部構造。作答時要分清楚兩件事：某構造是否存在於該類群，以及它是否為該類群的典型特徵。細菌與古菌都屬原核生物，但古菌的細胞壁不含肽聚醣，細胞壁成分與細菌不同。

解題方法與選項分析

核心觀念

本題考氧氣在培養管中的分布，以及細菌對氧氣的需求與耐受性。培養管上方氧氣較多，往下逐漸減少；細菌在管中的生長位置，能反映它是否需要氧氣、是否能耐受氧氣。

活性氧清除酵素也可用來判斷細菌的氧氣耐受性：

• 超氧化物歧化酶（SOD）：將超氧陰離子轉成過氧化氫與氧氣。
• 過氧化氫酶（catalase）：將過氧化氫分解成水與氧氣。

解題方法

圖中，x 的生長沿整管近乎均勻分布，沒有集中在管口；y 的生長只出現在管底。因此，先依生長位置判斷氧氣關係，再依典型酵素特徵判定 SOD 與過氧化氫酶。

選項分析

核心觀念

本題考查三種抗生素各自作用的細菌細胞標的，以及它們如何阻斷細菌生長所需的生合成過程。可用「細胞壁、蛋白質、核酸」三類標的整理：

• Vancomycin（萬古黴素）：抑制細胞壁肽聚醣合成。
• Tetracyclines（四環黴素類）：抑制核糖體的蛋白質合成。
• Rifampin（利福平）：抑制細菌的轉錄。

作答時要交代清楚「藥物結合何處、阻斷哪個步驟、造成何種結果」。本題沒有計算，也不涉及選擇題選項判斷。

解題方法

依序追蹤細菌細胞壁、核糖體與轉錄機制，將每種藥物的作用位置連到受阻的生合成步驟，即可完整說明作用機制。

（1）Vancomycin（萬古黴素）

萬古黴素是糖肽類抗生素，會結合肽聚醣前驅物末端的 D-Ala-D-Ala。這個末端結構位於脂質 II 等細胞壁前驅物上；萬古黴素結合後，會妨礙前驅物被納入細胞壁，抑制肽聚醣的聚合與交聯，造成細胞壁合成受阻。細胞壁無法正常形成，細菌便容易因滲透壓等因素而受損。萬古黴素是透過結合細胞壁前驅物來阻礙合成，與青黴素類直接抑制青黴素結合蛋白的方式不同。NCI 藥物字典、NCBI Bookshelf：抗菌化學治療

（2）Tetracyclines（四環黴素類）

四環黴素類會可逆地結合細菌核糖體的 30S 次單元，阻止胺醯化 tRNA 進入核糖體的 A 位點。在正常延長過程中，胺醯化 tRNA 進入 A 位點，提供下一個胺基酸以延長胜肽鏈；此步驟受阻後，蛋白質合成便無法正常進行。四環黴素類因此抑制細菌蛋白質合成，通常屬於抑菌性抗生素。

核心觀念

聚合酶連鎖反應（PCR）利用兩條引子界定目標 DNA 的兩端，並在反覆的溫度循環中複製兩引子之間的 DNA 片段。每一輪新合成的 DNA 又能成為下一輪的模板，因此理想情況下，目標片段會呈指數倍增加。

解題方法

描述 PCR 時，依序說明反應材料、每輪的三個步驟，以及產物如何累積：

1. 準備反應材料：模板 DNA、分別與目標區域兩端互補的正向與反向引子、耐熱 DNA 聚合酶（如 Taq 聚合酶）、四種去氧核苷三磷酸（dNTP），以及含鎂離子的反應緩衝液。

2. 變性：加熱至約 $94$–$98^\circ\mathrm{C}$，使雙股 DNA 的氫鍵解離，形成單股模板。

3. 引子退火：降溫至約 $50$–$65^\circ\mathrm{C}$，讓兩條引子分別與模板上互補的序列結合。引子的結合位置與方向決定被擴增片段的範圍。

4. 延伸：升溫至適合聚合酶作用的溫度；Taq 聚合酶常用約 $72^\circ\mathrm{C}$。聚合酶從引子的 $3'$ 端開始，依模板序列加入 dNTP，合成新的 DNA 股。

核心觀念

Riboswitch（核糖開關）是位於細菌 mRNA 5′ 非轉譯區（5′ UTR）的順式調控 RNA 元件。它通常包含兩個功能區：

• 適體區（aptamer domain）：辨認並結合特定小分子代謝物。
• 表現平台（expression platform）：依 RNA 的摺疊狀態，控制下游基因的表現。

核糖開關不需透過調控蛋白傳遞訊號；配體與 RNA 結合會改變新生 RNA 的二級結構，進而調節操縱組的轉錄。

解題方法

判斷其調控機制時，先看 RNA 結構是否影響轉錄終止。若表現平台可形成內在終止子，通常包括終止髮夾及其後的富含 U 序列，RNA 聚合酶會在操縱組末端之前停止轉錄。

以常見的「配體結合後關閉轉錄」型核糖開關為例：

核心觀念

群體感應（quorum sensing）是細菌利用可擴散的化學訊號分子，感知周遭細菌的族群密度，並在訊號累積至一定濃度時，協調改變基因表現的機制。訊號分子常稱為自誘導物（autoinducer）。

細菌會持續產生並釋放訊號分子。當細胞密度升高，訊號分子在局部環境中的濃度也隨之增加；達到反應閾值後，訊號便啟動或抑制特定基因，使族群同步表現某些性狀。這些性狀包括生物發光、生物膜形成、毒力因子分泌及孢子形成等。

解題方法

作答時，先交代「細胞密度—訊號累積—基因表現改變—群體性狀」的因果關係，再以一個具體菌種說明訊號與調控途徑。這樣能同時回答題目要求的定義、實例及作用機制。

實例：費氏弧菌的生物發光

費氏弧菌（Vibrio fischeri）可在夏威夷短尾魷的發光器官中共生，並藉由群體感應調控生物發光。

核心觀念

$D$ 值，又稱十進位減少時間（decimal reduction time），是指在特定環境與固定處理溫度下，使微生物的存活數減少一個對數單位所需的時間。減少一個對數單位代表存活數降為原來的 $10\%$，也就是減少 $90\%$。

解題方法

本題要求定義 $D$ 值，關鍵是掌握「固定溫度下，存活數減少十倍所需的時間」。若初始存活數為 $N_0$，經處理時間 $t$ 後的存活數為 $N_t$，則：

核心觀念

本題考查如何從「酵素活性、菌株代謝能力、工業培養條件」三個層次，提升 Ideonella sakaiensis 分解 PET 的效率與工業可行性。

PET 是由對苯二甲酸與乙二醇形成的聚酯。I. sakaiensis 的 PETase 先水解 PET，產生 MHET 等中間產物；MHETase 再將 MHET 水解為對苯二甲酸（TPA）與乙二醇（EG），供細胞進一步利用。PETase 負責聚合物分解，MHETase 與後續代謝途徑則影響分解產物的轉化與細胞生長。原始研究確認 I. sakaiensis 能以 PET 作為主要碳源與能源，後續基因剔除研究也指出 PETase 對 PET 分解至關重要。Yoshida 等人，2016、PETase 與 MHETase 基因剔除研究

工業化評估不能只看酵素在試管中的活性，還要考量酵素是否穩定、菌株是否能持續表現並利用產物，以及反應器中的 PET 表面接觸與傳質效率。

解題方法

將「提升 PET 降解」拆成三個瓶頸來處理：

1. 酵素本身：提升 PETase 的催化效率、耐熱性與對結晶 PET 的作用能力。
2. 菌株本身：提升 PETase、MHETase 的表現與分泌，並改善降解產物的攝取及代謝。
3. 工業製程：讓菌體、酵素與 PET 在反應器中有效接觸，並維持適合反應的環境條件。

依此可提出以下三項技術。

三項技術與原理

一、PETase 的理性設計與定向演化

先依據 PETase 的三維結構與活性位點，透過定點突變改變底物結合區、活性位點周邊結構或柔性區域，提升 PET 結合與水解效率；也可建立大量突變株，篩選 PET 分解速率較快、耐熱性較高的變異酵素，反覆進行「突變—篩選—再突變」，這就是定向演化。

工業應用特別重視酵素在實際操作溫度下的穩定性，以及對高結晶度 PET 的分解能力。研究已使用結構導向的蛋白質工程改造 IsPETase，並觀察到變異酵素對 PET 的分解表現提升。

核心觀念

本題考查不同微生物類群的代表性分類或生理特徵。作答時，每一類只需指出一項具有辨識力的特徵，並簡短說明其意義。六項分別涉及代謝方式、細胞壁與形態、細胞類型、噬菌體生活史、細胞膜與細胞壁，以及真菌與植物根部的共生關係。

解題方法與各項判別

(1) 硝化細菌（nitrifying bacteria）

**判別特徵：**以無機氮化合物作為能量來源，進行硝化作用。

硝化作用是將氨氧化為亞硝酸，再將亞硝酸氧化為硝酸的過程。典型硝化細菌以化學無機營養方式取得能量，許多種類也能利用二氧化碳作為碳源。不同菌種可負責其中一個氧化步驟。

**作答要點：**指出其可氧化氨或亞硝酸，並參與硝化作用，即可清楚區別。

(2) 放線菌門（Actinobacteria）

**判別特徵：**許多種類為革蘭氏陽性菌，且具有較高的基因組鳥糞嘌呤與胞嘧啶比例（高 G+C）。

部分放線菌會形成分枝、絲狀的生長型態，外觀近似真菌菌絲；但它們是細菌，並非真菌。高 G+C 含量是此類群常見的分類特徵。

**作答要點：**寫出「革蘭氏陽性且基因組 G+C 比例高」即可；寫出部分種類具有分枝絲狀形態，也可作為辨識特徵。

(3) 原生生物界（Kingdom Protists）

**判別特徵：**細胞為真核細胞，許多種類為單細胞生物。

原生生物可包含具有細胞核及膜狀胞器的生物，例如原生動物、部分藻類及黏菌等。這是傳統上使用的廣泛分類，涵蓋的生物型態多樣。

**作答要點：**以「真核」作為主要區別特徵，並補充許多種類為單細胞，可避免與細菌等原核生物混淆。

(4) 溫和型噬菌體（temperate bacteriophages）

核心觀念

本題考查「基礎微生物學發現如何轉化為生物技術工具」。作答時，對每項工具都要交代兩件事：它在自然界中的生物功能，以及研究者如何利用其特性。四者分別涉及細菌的防禦、發光、以及細菌與植物之間的基因轉移。

解題方法

依「自然功能 → 可利用的分子特性 → 現代用途」作答。先辨認各系統在生物體內的角色，再說明研究者如何控制或測量其作用。

(1) 限制酶（restriction enzymes）

**原始生物功能：**限制酶是細菌限制修飾系統的一部分，能辨識特定 DNA 序列並切割外來 DNA，例如噬菌體 DNA，協助細菌抵禦感染。細菌自身的辨識位點通常會經由甲基化修飾受到保護，降低被自身限制酶切割的機會。

**生物技術用途：**研究者利用限制酶在特定序列切割 DNA，以進行基因重組、DNA 圖譜分析、基因片段篩選及質體構築。常用的第二型限制酶能辨識特定短序列，並在辨識位點內或附近切割。切割後可能形成：

• **黏性末端：**帶有單股突出端，可與互補末端配對，利於 DNA 片段接合。
• **平端：**切口不形成突出端，仍可藉由 DNA 連接酶接合。

將目標片段與載體用相容的限制酶切割，再以 DNA 連接酶接合，即可構築重組 DNA。

(2) CRISPR-Cas

**原始生物功能：**CRISPR-Cas 是細菌與古菌的適應性免疫系統。微生物會將入侵者 DNA 的片段儲存在 CRISPR 序列中，形成間隔序列（spacer）；再次遇到相同或相近入侵者時，CRISPR 區域轉錄並加工成導引 RNA，與 Cas 蛋白合作辨識及切割目標核酸。

以 Cas9 為例，導引 RNA 與目標 DNA 配對，Cas9 還須辨識目標附近的 PAM 序列，才會切割 DNA。

**生物技術用途：**研究者可設計導引 RNA，使 Cas 蛋白定位到指定基因。DNA 切割後，細胞會啟動 DNA 修復：

• 若經由非同源末端接合修復，切口附近可能產生小型插入或缺失，造成基因失能。
• 若提供含有預定改變的修復模板，可利用同源導向修復導入特定序列變化。

CRISPR-Cas 因此可用於基因剔除、基因修飾、功能基因體學研究及作物性狀改良。其他 Cas 蛋白也可用於 RNA 操作或核酸檢測。

(3) 螢光素酶（luciferase）

核心觀念

本題考查綠藻細胞構造與環境適應的關係。葉綠體和蛋白核反映光合作用與碳固定需求；眼點協助感受光線；伸縮泡則負責調節細胞內水分，特別適應淡水環境。

解題方法

依原卷題幹，細胞具有大型杯狀葉綠體、明顯蛋白核、眼點，以及位於鞭毛基部的兩個小型伸縮泡。從光合作用構造判斷光照需求，再由伸縮泡判斷水分調節方式，據此推定適合的生長環境。

核心觀念與解題方法

本題考查微生物生態學中描述微生物群落的基本名詞。作答時可依「研究對象、分析方式、培養策略、細胞狀態」分類：微生物群落是研究對象；宏基因組學與 PhyloChip 是分析群落的方法；培養組學與增菌培養是培養策略；VBNC 則描述微生物的生理狀態。逐一定義時，並指出各方法能提供的資訊及其限制。

各名詞定義

(1) Microbiota（微生物群）

指特定環境或棲位中共同存在的微生物集合，例如土壤、根圈、海水或動物腸道中的細菌、古菌、真菌、病毒等。重點是該棲位中的微生物成員及其組成；「microbiome（微生物組）」一詞常用來指微生物群及其遺傳物質、功能與所處環境等較廣的整體概念，實際用法會依文獻而異。

(2) Metagenomics（宏基因組學）

直接從環境樣本中的微生物群落取得遺傳物質，進行基因體層級分析，而不必先將每種微生物分離培養。常見方法包括對特定標記基因（如 16S rRNA 基因）進行定序，以分析群落分類組成；或進行全基因組隨機定序（shotgun sequencing），以同時調查群落的基因組成與潛在功能。宏基因組資料揭示的是遺傳潛能，單靠 DNA 序列不能直接證明基因當下正在表現或產生作用。ASM 宏基因組學定義與分析概述

(3) Culturomics（培養組學）

以高通量方式系統性改變培養條件，例如培養基組成、溫度、酸鹼值、氧氣條件及培養時間，培養並分離樣本中的微生物，再以快速鑑定技術（如 MALDI-TOF 質譜或 16S rRNA 基因定序）辨認菌株。其目的在於提高可培養微生物的多樣性與分離量，補足僅靠定序無法取得活菌株、進行生理或功能實驗的限制。培養組學是多條件、高通量培養策略，不是單一培養基或單一檢測技術。培養組學綜述

(4) PhyloChip（系統發育晶片）

一種用於分析微生物群落的高密度 DNA 微陣列。晶片上排列許多針對不同微生物類群 16S rRNA 基因序列設計的探針；將環境樣本中擴增出的 16S rRNA 基因片段與晶片探針雜交，再依雜交訊號判定樣本中可偵測到哪些類群。PhyloChip 可快速比較樣本的原核生物群落組成，但檢測範圍受探針設計限制，且主要提供分類資訊，不能直接代表微生物的活性或功能。

核心觀念

本題考古姆斯－蓋爾（Gell–Coombs）四型過敏反應的分類，判斷關鍵是造成組織損傷的免疫機制：

解題方法

先抓題幹中的機制關鍵字，再對照四型分類：看到「肥大細胞表面 IgE」判為 I 型；「免疫複合體」判為 III 型；「結核菌素」或典型細胞性移植排斥判為 IV 型；新生兒溶血症則屬抗體攻擊紅血球的 II 型。

選項分析

(1) Erythroblastosis fetalis：B，II 型過敏反應。
胎兒紅血球表面的 Rh 抗原遭母體產生的 IgG 抗體辨識，抗體可經胎盤進入胎兒循環並破壞紅血球，因此屬抗體媒介的細胞傷害型反應，即 II 型。

核心觀念

酵素連結免疫吸附分析法（ELISA）利用抗原與抗體的專一性結合，並以酵素標記的抗體催化呈色反應。加入受質後，顏色訊號代表目標物存在；在適當條件下，訊號強度也可用來估計目標物的量。

判斷 ELISA 類型的關鍵，是看樣品中的目標物是抗原還是抗體，以及酵素標記抗體在檢測流程中扮演的角色。

解題方法

1. 直接 ELISA（direct ELISA）

將樣品中的抗原固定於固相載體，再加入直接帶有酵素標記的專一性抗體，使其與抗原結合。洗去未結合的抗體後加入受質，若出現呈色訊號，表示樣品中有該抗原。

流程可概括為：

2. 間接 ELISA（indirect ELISA）

先將已知抗原固定於固相載體，再加入待測血清。若血清含有能辨識該抗原的特異性抗體，便會與固定抗原結合。接著加入帶有酵素標記、可辨識待測抗體的二級抗體，最後加入受質呈色。

流程可概括為：

3. 夾心 ELISA（sandwich ELISA）