108 年 國立臺灣大學農業化學系碩士班乙組《微生物學（A）》

此題主要在測試學生對 Gram 染色步驟及其原理的理解。Gram 染色是區分細菌細胞壁結構的基礎方法，其原理在於細胞壁成分對染劑和脫色劑的反應不同。

Gram 染色步驟包含：

1. 初染：使用結晶紫 (crystal violet) 染色所有細胞。
2. 媒染：加入碘液 (iodine)，使結晶紫-碘複合物沉澱在細胞壁內。
3. 脫色：使用酒精或丙酮等有機溶劑，脫去細胞壁中的脂質，並使 Gram 陰性菌細胞壁變薄，複合物逸出。
4. 复染：使用沙夫林 (safranin) 染色，賦予脫色後的細胞顏色。

此題考驗學生對基因表現調控及現代基因體學 (genomics) 工具的了解，特別是如何量化細胞在特定條件下的轉錄物 (transcripts) 和蛋白質表現。

基因表現是指細胞將遺傳資訊 (DNA) 轉化為功能性產物（主要是蛋白質）的過程。這個過程包含轉錄 (transcription) 和轉譯 (translation)。測量基因表現通常是透過量化 mRNA 的量 (轉錄物) 或蛋白質的量。

現代基因體學提供了多種強大的工具來研究基因表現，主要分為兩大類：

1. 測量轉錄物 (mRNA) 的量：

   • 微陣列 (Microarrays)： 這是較早期的技術。將已知序列的 DNA 探針固定在載玻片上，然後將細胞中提取的 mRNA 反轉錄成 cDNA，並進行標記後與微陣列上的探針雜交。訊號強度與該 mRNA 的表現量成正比。
   • RNA 定序 (RNA Sequencing, RNA-Seq)： 這是目前最主流的技術。將細胞中提取的 RNA（通常是 mRNA）打斷成小片段，反轉錄成 cDNA，然後進行高通量定序。透過比對定序讀序 (reads) 與參考基因體，可以定量每個基因的表現量。RNA-Seq 不僅能定量，還能偵測新的轉錄本、剪接變異等。
   • 定量聚合酶鏈反應 (Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR)： 這是較為精確且常用的方法，用於驗證其他高通量技術的結果，或對特定基因進行精確定量。以螢光訊號偵測 PCR 產物的累積，直接與起始的 mRNA 量相關。

2. 測量蛋白質的量：

   • 西方墨點法 (Western Blotting)： 這是測量特定蛋白質量最常用的方法。

此題要求定義五個生物學術語，涵蓋分子生物學、基因工程與藥物學等領域。

(1) Random mutagenesis (隨機誘變)：
隨機誘變是指在生物體或細胞的基因組中，隨機地引入突變的一種過程。這種突變可以在基因組的任何位置發生，且突變的類型（點突變、插入、刪除等）也可能是不確定的。常用的誘變劑包括化學誘變劑（如亞硝基胍、溴尿嘧啶）和物理誘變劑（如紫外線、X 射線）。隨機誘變常用於篩選具有特定表型的有用突變株，例如提高產量、增強抗性或改變代謝途徑。

(2) Site-directed mutagenesis (定點誘變)：
定點誘變是一種分子生物學技術，允許研究人員精確地在 DNA 分子的特定位置引入預先設計好的突變。這通常透過合成寡核苷酸引物 (primer) 來實現，該引物包含一個或多個錯配鹼基，然後用其作為模板進行 DNA 聚合反應。定點誘變的優點在於其精確性，可以研究特定基因區域或核苷酸對蛋白質結構、功能或基因調控的影響。

(3) Fusion proteins (融合蛋白)：
融合蛋白是由兩個或多個不同蛋白質的序列連接而成的一種蛋白質。通常透過基因工程技術，將編碼這些蛋白質的基因片段連接起來，形成一個單一的開放閱讀框 (open reading frame, ORF)，然後進行表現。融合蛋白可以結合來自不同蛋白質的特性，例如增強穩定性、改善標記能力（如與螢光蛋白融合）、或用於研究蛋白質-蛋白質交互作用。

此題考驗學生對不同類型細菌發酵途徑的理解，特別是碳水化合物發酵的產物及其差異。發酵是無氧條件下，微生物分解有機物以獲取能量的一種代謝途徑。

1. 酒精發酵 (Alcoholic Fermentation)：
主要由酵母菌 (yeast) 和部分細菌進行。葡萄糖首先經過糖解作用 (glycolysis) 產生丙酮酸 (pyruvate)。接著，丙酮酸脫羧生成乙醛 (acetaldehyde) 和二氧化碳 (CO2)。最後，乙醛被還原成乙醇 (ethanol)。
總反應式簡化為：
$C_6H_{12}O_6 \rightarrow 2 C_2H_5OH + 2 CO_2$
主要產物：乙醇、二氧化碳。

2. 乳酸發酵 (Lactic Acid Fermentation)：
主要由乳酸菌 (lactic acid bacteria) 進行。葡萄糖經糖解作用產生丙酮酸。

• 同型乳酸發酵 (Homofermentative)： 丙酮酸直接被還原成乳酸。
  總反應式簡化為：$C_6H_{12}O_6 \rightarrow 2 C_3H_6O_3$ (乳酸)
  主要產物：乳酸。
• 異型乳酸發酵 (Heterofermentative)： 丙酮酸除了生成乳酸外，還會產生乙醇、乙酸、二氧化碳等其他產物。

3. 混合酸發酵 (Mixed Acid Fermentation)：
主要由腸內菌科 (Enterobacteriaceae) 的細菌進行，如大腸桿菌 (E. coli)、沙門氏菌 (Salmonella)。葡萄糖經糖解作用產生丙酮酸，丙酮酸會進一步分解產生多種酸性產物，如乳酸、乙酸、琥珀酸 (succinic acid)、甲酸 (formic acid)，同時產生氫氣 (H2) 和二氧化碳 (CO2)。
主要產物：多種有機酸（乳酸、乙酸、琥珀酸、甲酸）、H2、CO2。

4. 丁二醇發酵 (Butanediol Fermentation)：
主要由部分腸內菌科細菌進行，如產氣莢膜桿菌 (Enterobacter aerogenes)。葡萄糖經糖解作用產生丙酮酸。丙酮酸會先轉化為乙醯丙酮酸 (acetoin)，然後進一步被還原成 2,3-丁二醇 (2,3-butanediol)。此途徑通常伴隨產生乙醇、乳酸、乙酸、甲酸、H2 和 CO2。

此題考查學生對蘇力桿菌 (Bacillus thuringiensis, Bt) 的特殊結構——寄生孢子體 (parasporal body) 的理解，以及其在農業上的應用。

1. 什麼是寄生孢子體 (parasporal body)？ (2%)
寄生孢子體是某些細菌，特別是蘇力桿菌 (Bacillus thuringiensis, Bt) 在孢子形成後期（通常在細菌死亡前）產生的一種蛋白質結晶結構，附著在芽孢 (spore) 旁邊，故稱為「寄生」於孢子旁。這種結晶結構主要由一種或多種殺蟲蛋白質 (insecticidal crystal proteins, ICPs) 組成，也被稱為 δ-內毒素 (delta-endotoxins)。這些蛋白質在結構和功能上是獨特的，它們在特定 pH 和酶的環境下會被活化，並對某些昆蟲產生毒性。

2. 在蘇力桿菌 (Bacillus thuringiensis) 中，請描述其寄生孢子體的功能以及在農業領域的應用機制。(3%)

• 功能 (Function)：
  寄生孢子體的主要功能是作為一種 殺蟲劑。這些蛋白質晶體在昆蟲的消化道中，受到鹼性 pH 和蛋白酶的作用，會被溶解並活化成較小的毒性肽段。這些活化的毒肽會與昆蟲腸道上皮細胞膜上的特定受體結合，形成離子通道，導致細胞膜通透性改變，離子外流，細胞腫脹、壞死，最終導致昆蟲死亡。不同的 Bt 菌株產生不同的殺蟲蛋白質晶體，對不同種類的昆蟲具有不同的殺傷力。

此題考查學生對放線菌 (Actinomycete) 的生長發育、產物分類以及孢子類型的理解。放線菌是一類形態上類似真菌的細菌，具有特殊的生命週期。

1. 放線菌從活躍生長的營養細胞轉變為特殊細胞類型是 (a) 菌絲 (hyphae) (b) 孢子 (spore)（請選擇一項，2%）。
放線菌的生命週期始於營養細胞，這些細胞會伸長形成絲狀結構，稱為 菌絲 (hyphae)。菌絲可以進一步分支，形成一個菌絲體 (mycelium)，用於吸收營養。當環境條件不利時，菌絲頂端或特殊結構會分化形成孢子，用於繁殖和傳播。因此，從活躍生長的營養細胞轉變為具有吸收功能的結構是菌絲。
【答案】(a) hyphae

2. 這些化合物通常被稱為 (c) 初級代謝物 (primary metabolite) (d) 次級代謝物 (secondary metabolite)（請選擇一項，2%）。

此題考查學生對 CRISPR/Cas 系統在細菌和古菌中的功能理解。CRISPR/Cas 系統是一種適應性免疫系統，能夠抵禦外源遺傳物質（如噬菌體和質粒）的入侵。

CRISPR/Cas 系統的功能：

CRISPR/Cas 系統是一種反噬菌 (anti-phage) 的免疫系統，存在於絕大多數細菌和古菌中。它主要有三個階段：

1. 適應階段 (Adaptation)： 當外源 DNA（如噬菌體 DNA）入侵細胞時，Cas 蛋白（一種核酸酶）會將外源 DNA 切割成小片段，其中一些片段會被整合到細菌/古菌基因組中的 CRISPR 區域 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)。這些整合的片段稱為「間隔序列」(spacer)。這些間隔序列的序列與入侵者的 DNA 序列相似，就像是免疫系統的「記憶」或「記錄」。
2. 表現階段 (Expression)： CRISPR 區域的 DNA 會被轉錄成前驅 RNA (pre-crRNA)。隨後，這個前驅 RNA 會被加工成較短的 CRISPR RNA (crRNA)，每個 crRNA 包含一個間隔序列和一個重複序列。

此題考查學生對反轉錄酶 (reverse transcriptase) 的定義及其在反轉錄病毒 (Retroviruses) 中的功能的理解。

反轉錄酶 (Reverse Transcriptase)：
反轉錄酶，也稱為 RNA 依賴性 DNA 聚合酶 (RNA-dependent DNA polymerase)，是一種酶，它能夠以 RNA 為模板合成 DNA。這是一個「反向」的過程，因為在標準的分子生物學中心法則中，遺傳資訊的流動是 DNA → RNA → 蛋白質，而反轉錄酶使得 RNA → DNA 的資訊流成為可能。

在反轉錄病毒 (Retroviruses) 中的功能：
反轉錄病毒是一類特殊的 RNA 病毒，例如人類免疫缺乏病毒 (HIV)。它們的基因組是單鏈 RNA。當反轉錄病毒感染宿主細胞時，它們會將自己的 RNA 基因組注入細胞質。此時，反轉錄酶就發揮關鍵作用：

1. RNA 依賴性 DNA 合成： 反轉錄酶首先以病毒的 RNA 基因組為模板，合成一條互補的 DNA 鏈 (cDNA)，形成一個 RNA-DNA 雜合分子。

此題包含兩個獨立的定義題，分別考查傳染病學中的「fomite」概念以及生物技術在礦業中的應用「metal bioleaching」。

1. 什麼是載體傳播中的 fomite？ (2%)
Fomite（或稱「物體傳播媒介」）是指 無生命的物體表面，這些物體表面可能沾染了病原體（如細菌、病毒、真菌、寄生蟲），並能將這些病原體從一個感染源傳播給一個易感宿主。在疾病的 載體傳播 (vehicle transmission) 過程中，fomite 扮演著重要的媒介角色。

例如：

• 門把、桌面、電話聽筒、玩具等被感染者接觸後，可能沾染呼吸道飛沫或分泌物中的病原體。
• 他人接觸這些被污染的物體表面後，再觸摸自己的口、鼻、眼黏膜，就可能導致感染。
• 醫療器械、衣物、毛巾等也是常見的 fomite。

2. 貴金屬開採中的金屬生物浸出 (metal bioleaching) 是什麼？ (2%)
金屬生物浸出 (Metal Bioleaching)，又稱生物淋溶 (biomining)，是一種利用微生物（主要是細菌和古菌）的代謝活性來從礦石中提取金屬的技術。

此題要求定義三個與代謝相關的微生物類群：產甲烷菌 (Methanogens)、產甲烷菌 (Methanotrophs) 和甲基營養菌 (Methylotrophs)。

1. 產甲烷菌 (Methanogens)：

• 定義： 產甲烷菌是一類古菌 (Archaea)，它們的特點是通過 產甲烷作用 (methanogenesis) 來獲取能量。產甲烷作用是將單碳化合物（如二氧化碳 $CO_2$、甲酸 $formate$）或含氫化合物（如氫氣 $H_2$）還原，最終生成甲烷 ($CH_4$)。
• 代謝特點：
  • 它們是嚴格的 厭氧菌，在有氧環境下無法生存。
  • 它們的能量代謝途徑獨特，不依賴氧氣作為最終電子受體。
  • 常見的產甲烷途徑包括：
    • $CO_2 + 4H_2 \rightarrow CH_4 + 2H_2O$ （二氧化碳還原）
    • $CH_3OH + H_2 \rightarrow CH_4 + H_2O$ （甲醇還原）
    • $CH_3COOH \rightarrow CH_4 + CO_2$ （乙酸裂解）
• 生態位： 廣泛存在於缺氧環境中，如濕地、沼澤、動物消化道（牛瘤胃、腸道）、廢水處理場等。

2. 產甲烷菌 (Methanotrophs)：

• 定義： 產甲烷菌 (Methanotrophs) 是一類細菌（屬於變形菌門 Proteobacteria），它們能夠 氧化甲烷 ($CH_4$) 作為唯一的碳源和能源。
• 代謝特點：
  • 它們是 好氧菌，需要氧氣作為最終電子受體來氧化甲烷。
  • 氧化甲烷的過程涉及兩種關鍵酶：甲烷單加氧酶 (Methane Monooxygenase, MMO) 和甲醛脫氫酶 (Formaldehyde Dehydrogenase)。

此題包含兩個獨立的問題，分別考查生物膜 (biofilm) 的概念以及 SARS 病毒消失的原因。

1. 什麼是生物膜 (biofilm)？ (2%)
生物膜 (biofilm) 是微生物（如細菌、真菌、藻類）附著在固體表面（包括生物表面如牙齒、組織，或非生物表面如水管、醫療植入物）上，並分泌一種胞外多醣基質 (extracellular polymeric substance, EPS) 將自身包裹起來形成的一種結構化的群落。

生物膜的特點：

• 結構複雜： 具有通道和空腔，便於營養物質和廢物的運輸。
• 保護作用： EPS 基質能保護其中的微生物免受抗生素、消毒劑、宿主免疫系統以及乾燥等不利環境的影響。
• 群體行為： 生物膜中的微生物可以進行協同作用，表現出與單細胞懸浮狀態不同的生理特性（如基因表達、代謝）。
• 附著性： 能夠牢固地附著在各種表面上，難以清除。

生物膜在醫學（如慢性感染、植入物感染）和工業（如管道結垢、食品污染）中都具有重要意義。

2. 為什麼 SARS 消失了？ (2%)
SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) 是一種由 SARS 冠狀病毒 (SARS-CoV) 引起的人畜共通傳染病，在 2002-2003 年大流行。該病毒最終被認為已經在人群中消失，主要原因可歸結為以下幾點：

• 有效且及時的公共衛生措施：
  • 隔離： 嚴格的隔離措施有效阻止了病毒的進一步傳播。
  • 接觸追蹤： 快速追蹤和檢測感染者及其接觸者，並進行隔離。

此題考查學生對免疫系統中兩種關鍵淋巴細胞——B 細胞和 T 細胞——的作用和功能的理解。它們是適應性免疫 (adaptive immunity) 的核心組成部分。

B 細胞 (B cells) 的作用和功能：
B 細胞是體液免疫 (humoral immunity) 的主要執行者。

• 抗體產生 (Antibody Production)： B 細胞最重要的功能是產生抗體 (antibody)。每個 B 細胞表面的 B 細胞受體 (B cell receptor, BCR) 能夠識別特定的抗原決定基 (epitope)。當 B 細胞受到抗原刺激並獲得 T 細胞輔助（對於 T 細胞依賴性抗原）後，會發生增殖和分化，形成漿細胞 (plasma cells) 和記憶 B 細胞 (memory B cells)。
  • 漿細胞： 是高度特化的細胞，能夠分泌大量的、與其 BCR 相同特異性的抗體。抗體可以結合到抗原上，通過多種機制清除病原體，例如：
    • 中和 (Neutralization)： 抗體結合到病毒或細菌毒素的表面，阻止其感染細胞或發揮毒性。
    • 調理作用 (Opsonization)： 抗體包圍病原體，促進吞噬細胞（如巨噬細胞）識別和吞噬。
    • 補體系統激活 (Complement Activation)： 抗體結合抗原後，可以啟動補體級聯反應，導致病原體裂解、炎症反應和調理作用。
  • 記憶 B 細胞： 在初次感染後存活下來，能夠對相同的抗原產生更快速、更強烈的二次免疫反應。
• 抗原呈遞 (Antigen Presentation)： B 細胞也可以作為抗原呈遞細胞 (APC)，將結合在其 BCR 上的抗原內吞、處理，並在細胞表面呈遞給 T 輔助細胞 (T helper cells)，這對於 T 細胞依賴性 B 細胞的活化至關重要。

T 細胞 (T cells) 的作用和功能：
T 細胞是細胞免疫 (cell-mediated immunity) 的主要執行者，它們在細胞內識別抗原。T 細胞主要分為兩大類：T 輔助細胞 (T helper cells, Th) 和細胞毒殺 T 細胞 (cytotoxic T lymphocytes, CTLs)。

此題包含兩個獨立的問題，分別考查超級抗原 (superantigen) 在免疫活動中的作用，以及 B 細胞活化 (B-cell activation) 的功能。

1. 超級抗原 (super-antigen) 在免疫活動中的功能是什麼？ (2%)
超級抗原 (superantigen, SAgs) 是一類特殊的抗原，它們能夠 非特異性地、大規模地激活 T 細胞。與一般抗原需要經過抗原呈遞細胞處理，並被 T 細胞受體 (TCR) 的特定 Vβ 區域識別不同，超級抗原可以同時與 T 細胞受體 (TCR) 的 Vβ 區域以及人類白血球抗原 (MHC) Class II 分子結合。

• 作用機制：
  • 超級抗原可以結合到 MHC Class II 分子所在的細胞表面（如 APCs），並同時與 T 細胞表面的 TCR 的 Vβ 區結合。
  • 這種結合方式 不依賴於 TCR 與抗原肽段的特異性識別。
  • 因此，超級抗原能夠同時激活大量 T 細胞克隆（佔 T 細胞總數的 5-20%），而不是僅激活一小部分特異性 T 細胞。
• 免疫效應：
  • 大規模細胞因子風暴 (Cytokine Storm)： 大量 T 細胞的激活會導致釋放出巨量的細胞因子，如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、介白素-2 (IL-2) 等。這種細胞因子風暴可能引起嚴重的全身性炎症反應，導致發燒、低血壓、休克，甚至死亡（如食物中毒中的金黃色葡萄球菌毒性休克症候群）。
  • 免疫耗竭： 大量 T 細胞的激活和死亡，可能導致免疫系統的耗竭。
  • 免疫耐受或無反應： 雖然激活大量 T 細胞，但由於是非特異性的，對真正的病原體保護作用可能有限。

超級抗原通常由細菌或病毒產生，是引起某些感染性疾病（如食物中毒、中毒性休克症候群）或自體免疫疾病的因素之一。

2. B 細胞活化 (B-cell activation) 的功能是什麼？ (2%)

此題要求定義兩個與微生物應用相關的術語：益生菌 (probiotics) 和生物修復 (bioremediation)。

1. 益生菌 (probiotics) 是什麼？ (2%)
益生菌 (probiotics) 是指 活的微生物，當以足夠的量攝入時，能夠對宿主產生健康益處。這些微生物通常是細菌，但也包括酵母菌。

• 主要特點：
  • 活的微生物： 必須是活的才能發揮作用。
  • 足夠的量： 攝入量必須達到一定的水平才能產生效果。
  • 對宿主有益： 能夠改善宿主的健康狀況，例如通過維持腸道菌群平衡、增強免疫功能、幫助消化吸收等。
• 常見來源： 許多益生菌來自於發酵食品，如優格 (yogurt)、克菲爾 (kefir)、泡菜 (kimchi)、康普茶 (kombucha) 等。常見的益生菌菌種包括乳酸桿菌屬 (Lactobacillus) 和雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)。
• 作用機制： 益生菌可能通過多種方式發揮作用，包括：
  • 與腸道病原菌競爭營養和附著位點。
  • 產生抑菌物質（如乳酸、過氧化氫）。
  • 調節宿主的免疫系統。
  • 改善腸道屏障功能。
  • 產生有益的代謝產物（如短鏈脂肪酸）。