111 年 國立臺灣大學生命科學研究所《分子與細胞生物學》

Angiogenesis 是指新生血管的生成過程。這個過程在胚胎發育、傷口癒合、以及女性的月經週期中是正常的生理現象，但在腫瘤的生長和轉移中扮演關鍵角色。

iPSC 是 induced pluripotent stem cells 的縮寫，中文稱為誘導性多能幹細胞。

G 蛋白（Guanine nucleotide-binding proteins）是一類參與細胞內訊息傳遞的蛋白質。它們的運作機制是作為分子開關，透過與鳥糞嘌呤核苷酸（GTP 或 GDP）結合來調節其活性。

3'UTR 是 messenger RNA (mRNA) 分子中，位於終止密碼子（stop codon）下游，直到 mRNA 分子 3' 端之間的一段非轉譯區（untranslated region）。

端粒（Telomere）是真核細胞染色體末端的特殊結構，由重複性的 DNA 序列（在人類為 TTAGGG）和蛋白質（稱為保護複合體，shelterin）組成。

聯會複合體（Synaptonemal complex）是在減數分裂（meiosis）過程中，同源染色體配對（synapsis）時形成的一種蛋白質結構。

蛋白質體（Proteasome）是一種存在於真核細胞質和細胞核中的大型蛋白質複合體，主要功能是降解細胞內不需要或受損的蛋白質。

轉錄體（Transcriptome）是指在特定時間點、特定細胞或組織中，所有轉錄出來的 RNA 分子（包括 mRNA、rRNA、tRNA、miRNA 等）的總集合。它反映了基因的表現狀態，是基因組（genome）的轉錄產物。

旁分泌（Autocrine signaling）是一種細胞訊號傳遞的方式，其中一個細胞釋放一個訊號分子，該訊號分子接著作用於同一細胞上的受體，從而調節該細胞自身的生理活動。

非編碼 RNA（Non-coding RNAs, ncRNAs）是指那些無法轉譯成蛋白質的 RNA 分子。它們的種類繁多，功能各異，包括：

1. 核糖體 RNA (rRNA)：構成核糖體的主要成分。
2. 轉運 RNA (tRNA)：在蛋白質合成中攜帶胺基酸。
3. 小核仁 RNA (snoRNA)：參與 rRNA 的修飾。
4. 小核 RNA (snRNA)：參與 mRNA 前體的剪接。

轉錄後調控（Post-transcriptional regulation）是指在 mRNA 被轉錄出來之後，到蛋白質被合成之前，對基因表現進行的調控。在真核生物中，這是一個非常重要的調控層次，主要涉及以下幾個關鍵機制：

1. mRNA 剪接 (mRNA Splicing)：

   • 機制：真核基因的轉錄產物（pre-mRNA）包含外顯子（exons）和內含子（introns）。剪接的過程是將內含子移除，並將外顯子連接起來，形成成熟的 mRNA。
   • 調控方式：
     • 選擇性剪接 (Alternative Splicing)：一個 pre-mRNA 可以透過不同的剪接組合方式，產生多種不同的 mRNA 分子，進而轉譯出多種蛋白質異構體（isoforms）。這大大增加了基因表現的多樣性。例如，某些剪接因子（splicing factors）的結合或抑制，可以決定哪些外顯子被包含或排除在最終的 mRNA 中。

2. mRNA 編輯 (mRNA Editing)：

   • 機制：在某些情況下，mRNA 分子中的核苷酸序列會被化學修飾，改變其鹼基組成，進而改變其所編碼的蛋白質序列或調控其穩定性。
   • 調控方式：例如，腺苷去胺酶（adenosine deaminase）可以將腺苷（A）編輯成次黃嘌呤（I），次黃嘌呤在轉譯時常被讀碼成鳥糞嘌呤（G），這會改變胺基酸序列。

3. mRNA 運輸 (mRNA Transport)：

   • 機制：成熟的 mRNA 需要從細胞核運輸到細胞質中進行轉譯。
   • 調控方式：這個運輸過程受到嚴格調控，確保 mRNA 只在正確的時間和地點被釋放到細胞質中。例如，某些 RNA 結合蛋白會識別成熟的 mRNA 並與之結合，引導其通過核孔複合物。

4. mRNA 穩定性與降解 (mRNA Stability and Degradation)：

   • 機制：mRNA 分子的壽命（stability）決定了蛋白質的合成量。

細胞內鈣離子 ($Ca^{2+}$) 在細胞生理學中扮演著極為關鍵且多樣化的角色，其濃度受到嚴格調控。

細胞內鈣離子的生物學功能：

1. 細胞訊號傳遞 (Cell Signaling)：

   • 鈣離子是重要的第二信使（second messenger）。當細胞收到外部訊號（如激素、神經傳導物質）時，細胞膜上的受體會被活化，進而觸發細胞內鈣離子濃度的暫時性升高（通常是從nM 級別升高到 $\mu M$ 級別）。
   • 這種鈣離子濃度的瞬時變化可以激活一系列鈣離子依賴性蛋白質，例如：
     • 鈣調蛋白 (Calmodulin)：鈣離子與鈣調蛋白結合後，會改變其構象，進而激活下游的目標蛋白質，如蛋白質激酶（如 CaMKII）或磷酸酶。
     • 蛋白激酶 C (PKC)：某些 PKC 亞型需要鈣離子和磷脂的協同作用才能被激活。
     • 離子通道：鈣離子可以調節各種離子通道的開啟，影響細胞膜電位和離子通透性。

2. 肌肉收縮 (Muscle Contraction)：

   • 在骨骼肌、心肌和平滑肌中，鈣離子是啟動收縮過程的關鍵。
   • 在肌細胞中，鈣離子與肌鈣蛋白 C (troponin C) 結合，導致肌球蛋白（myosin）與肌動蛋白（actin）之間的交互作用，從而引發肌肉收縮。

3. 神經傳導 (Neurotransmission)：

   • 當神經衝動傳遞到神經末梢時，電壓依賴性鈣離子通道打開，鈣離子內流，觸發突觸囊泡（synaptic vesicles）釋放神經傳導物質。

4. 細胞內物質運輸與分泌 (Intracellular Transport and Secretion)：

   • 鈣離子參與調控囊泡的運輸、融合和釋放，例如在激素分泌、酶分泌和神經傳導物質釋放過程中。

5. 細胞凋亡 (Apoptosis)：

   • 鈣離子濃度的異常升高也可能觸發或調節細胞凋亡的過程。

6. 基因表現調控 (Gene Expression Regulation)：

   • 鈣離子可以通過激活特定的轉錄因子（如 NFAT）來影響基因的轉錄。

細胞如何維持鈣離子穩態 (Calcium Homeostasis)：

細胞內鈣離子的穩態受到嚴格的精確調控，以確保其濃度維持在相對低的基礎水平（約 100 nM），但在需要時能快速升高。這種穩態的維持依賴於多種離子轉運蛋白和細胞器：

1. 鈣離子泵 (Calcium Pumps)：
   • 質膜鈣 ATP 酶 (Plasma Membrane Ca$^{2+}$ ATPase, PMCA)：這些 ATP 酶將細胞內的鈣離子主動泵出細胞外，消耗 ATP。

嚴重特殊傳染性肺炎（COVID-19）是由嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒 2（SARS-CoV-2）引起的。SARS-CoV-2 的生命週期涉及病毒進入宿主細胞、複製、組裝以及釋放，以下詳細描述其過程：

1. 病毒進入人體細胞 (Viral Entry into Human Cells)：

SARS-CoV-2 是一種 RNA 病毒，其表面覆蓋著棘蛋白（Spike protein, S protein）。棘蛋白是病毒進入細胞的關鍵。

• 結合目標細胞：SARS-CoV-2 的棘蛋白首先與人類細胞表面的血管張力素轉化酶 2（Angiotensin-Converting Enzyme 2, ACE2）受體結合。ACE2 主要存在於呼吸道上皮細胞、肺泡 II 型細胞、心臟、腎臟和腸道等細胞上。棘蛋白的受體結合域（RBD）負責與 ACE2 結合。
• 蛋白酶切割：棘蛋白的 S1 和 S2 亞基在與 ACE2 結合後，需要被宿主細胞的蛋白酶（如 TMPRSS2，一種絲胺酸蛋白酶）在 S1/S2 鍵處進行切割，這有助於 S2 亞基的構象改變，暴露一個融合肽（fusion peptide）。
• 細胞膜融合：S2 亞基的融合肽插入宿主細胞膜，並引發病毒包膜與細胞膜的融合。這個融合過程將病毒的遺傳物質（RNA 基因組）釋放到細胞質中。
• 途徑：病毒進入細胞主要透過兩種途徑：
  • 膜融合 (Membrane Fusion)：棘蛋白在細胞表面被 TMPRSS2 等蛋白酶活化後，直接與細胞膜融合。
  • 內吞作用 (Endocytosis)：病毒被細胞內吞形成內體（endosome），隨後在內體酸性環境中，被內體蛋白酶（如 Cathepsins）切割活化，進而觸發病毒包膜與內體膜的融合，釋放病毒 RNA。

2. 病毒 RNA 複製與基因表現 (Viral RNA Replication and Gene Expression)：

• RNA 解碼與蛋白質合成：一旦病毒的單股正鏈 RNA 基因組（(+)ssRNA）進入細胞質，它就可以直接作為 mRNA 被細胞的核醣體識別和轉譯。
  • 首先，核醣體會轉譯出兩個大型的「開放閱讀框」（ORF1a 和 ORF1b），產生兩個多聚蛋白質（polyproteins），即 pp1a 和 pp1ab。
  • 這些多聚蛋白質隨後被病毒自身的蛋白酶（如 3CLpro 和 PLpro）切割，產生一系列非結構蛋白（non-structural proteins, NSPs），這些 NSPs 共同組成了病毒的 RNA 複製酶複合體。

原癌基因 (Proto-oncogenes) 的正常生物學功能：

原癌基因是細胞內原本存在的基因，它們在正常的細胞生長、分化和增殖過程中扮演著關鍵的調節角色。這些基因的產物通常是參與細胞訊號傳遞、生長因子、細胞週期調控、細胞分化和細胞凋亡等過程的蛋白質。它們的活性受到嚴格的調控，確保細胞在適當的時候、適當的程度下進行生長和分裂。

原癌基因的正常功能包括：

1. 生長因子受體：例如 EGFR（表皮生長因子受體），在細胞表面接收生長因子訊號，啟動下游的細胞生長和增殖。
2. 細胞內訊號傳遞分子：例如 Ras 蛋白家族，參與將細胞外生長訊號傳遞到細胞核，促進細胞週期進展。
3. 細胞週期調控因子：例如 Cyclins 和 Cyclin-dependent kinases (CDKs)，它們協同作用，推動細胞週期從一個階段進入下一個階段。
4. 轉錄因子：例如 Myc，可以結合 DNA，促進特定基因的轉錄，參與細胞增殖和分化。
5. 細胞凋亡調節因子：參與調控細胞死亡的程序。

原癌基因轉變為癌基因的遺傳學改變：

當原癌基因發生突變或其表現量異常升高時，它們就可能轉變為癌基因（oncogenes）。這種轉變通常是獲得性的（gain-of-function mutations），導致癌基因產物持續處於活躍狀態，不受正常調控，從而驅動細胞的無限增殖和癌變。主要的遺傳學改變包括：

1. 點突變 (Point Mutations)：

   • 在基因的特定位置發生單一鹼基的改變，可能導致編碼的蛋白質結構改變，使其持續活化。
   • 例子：Ras 基因的點突變，尤其是在第 12、13 或 61 位密碼子，會阻止 Ras 蛋白的水解 GTP 活性，使其持續處於 GTP 結合的活躍狀態。

2. 基因拷貝數增加 (Gene Amplification)：

   • 基因拷貝數的增加導致產生過多的 mRNA 和蛋白質產物，即使蛋白質本身沒有突變，其過量的存在也會促進細胞生長。
   • 例子：MYC 基因的拷貝數增加，在許多腫瘤中都觀察到，導致細胞週期失控。HER2 (ErbB2) 基因的拷貝數增加在某些乳腺癌中很常見，導致過度活化的生長因子受體訊號。

3. 染色體易位 (Chromosomal Translocations)：

   • 染色體之間發生片段交換，可能導致：
     • 將一個強啟動子（如免疫球蛋白基因的啟動子）連接到原癌基因上，使其過度表現。

這個實驗結果顯示，藥物 X 在 50 nM 的濃度下，不僅無法誘導神經前驅細胞 (YY cell) 分化為神經元，反而導致細胞死亡。這是一個非常重要的觀察，提示藥物 X 的作用機制並非預期的分化誘導，而是可能具有細胞毒性或干擾了細胞的存活機制。

基於此觀察，我會提出以下假設：

假設 1 (主要假設)：藥物 X 在 50 nM 的濃度下，對神經前驅細胞 (YY cell) 具有細胞毒性 (cytotoxicity)，直接導致細胞死亡，而非誘導分化。

假設 2 (次要假設)：藥物 X 可能干擾了 YY 細胞維持存活或抵抗細胞死亡所需的關鍵分子機制，間接導致細胞死亡。例如，藥物 X 可能抑制了某個維持細胞活力的訊號通路，或激活了細胞凋亡通路。

針對假設 1 的實驗設計 (測試藥物 X 的細胞毒性)：

為了驗證藥物 X 是否對 YY 細胞具有細胞毒性，我會進行以下實驗：

1. 劑量反應曲線 (Dose-Response Curve) 實驗：

   • 目的：確定藥物 X 引起細胞死亡的最低有效濃度和半數致死濃度 (LC50)。
   • 方法：
     • 將 YY 細胞培養在多孔盤中，並分別用一系列不同濃度的藥物 X 進行處理。濃度範圍應包含 50 nM，並涵蓋從極低濃度（如 1 nM）到高濃度（如 10 $\mu$M 或更高）的範圍。同時設置 DMSO（藥物載體）對照組和未處理的陰性對照組。
     • 培養一定時間（例如 24-72 小時），然後進行細胞存活率檢測。
   • 檢測方法：
     • MTT 或 WST-1 檢測：這些試劑可以測量細胞線粒體脫氫酶的活性，間接反映細胞的代謝活性和存活率。
     • 細胞計數：直接染色細胞並計數存活細胞的數量。
     • Annexin V/PI 染色：透過流式細胞儀 (flow cytometry) 分析，區分活細胞、早期凋亡細胞 (Annexin V 陽性, PI 陰性)、晚期凋亡細胞/壞死細胞 (Annexin V 陽性, PI 陽性) 和壞死細胞 (Annexin V 陰性, PI 陽性)。
   • 預期結果：如果藥物 X 在 50 nM 濃度或更低濃度就顯示出顯著的細胞死亡，則支持藥物 X 具有細胞毒性。劑量反應曲線將能更精確地描繪其毒性範圍。

2. 時間依賴性毒性實驗 (Time-Course Toxicity Assay)：

   • 目的：確定藥物 X 引起細胞死亡所需的時間。
   • 方法：
     • 在固定濃度的藥物 X（例如 50 nM）下，分別在不同時間點（如 6h, 12h, 24h, 48h, 72h）取樣進行細胞存活率檢測（如 MTT 或 Annexin V/PI 染色）。
   • 預期結果：如果細胞死亡在短時間內（如 24 小時內）就顯著發生，則進一步支持藥物 X 的急性細胞毒性。

針對假設 2 的實驗設計 (探討藥物 X 對細胞存活機制的干擾)：

如果劑量反應曲線顯示 50 nM 的藥物 X 確實引起了細胞死亡，並且初步證實其毒性，我會進一步探討其毒性機制，這可能也與干擾存活機制有關。

1. 凋亡標誌物檢測 (Apoptosis Marker Analysis)：
   • 目的：確定細胞死亡是否是通過凋亡途徑。
   • 方法：