109 年 國立臺灣大學生命科學研究所《分子與細胞生物學》

此題主要在探討細胞凋亡（apoptosis）過程中，兩大類關鍵蛋白質的角色：caspases 與 Bcl-2 家族蛋白。

核心觀念： 細胞凋亡是一個受嚴格調控的程序性細胞死亡過程，涉及一系列蛋白質的活化與作用，其中 caspases 是執行細胞凋亡的主要酵素，而 Bcl-2 家族蛋白則扮演著調控細胞凋亡途徑啟動與否的關鍵角色。

詳解：

Caspases 的功能：
Caspases（Cysteine-dependent Aspartate-directed proteases）是一類半胱胺酸蛋白酶，在細胞凋亡中扮演著「執行者」的角色。牠們以天冬胺酸殘基為切割位點，切割許多細胞內蛋白質，進而導致細胞結構的瓦解和細胞凋亡的發生。Caspases 的活化是細胞凋亡的關鍵事件。

• 起始 caspases (Initiator caspases)： 如 caspase-8、caspase-9。牠們接收來自凋亡訊號的啟動，並活化執行 caspases。
• 執行 caspases (Executioner caspases)： 如 caspase-3、caspase-6、caspase-7。牠們被起始 caspases 活化後，會大規模切割細胞內的底物蛋白質，例如 Lamin（核層蛋白）、PARP（Poly(ADP-ribose) polymerase）、細胞骨架蛋白等，最終導致細胞形態的改變（細胞收縮、形成凋亡小體）和 DNA 的片段化。

Bcl-2 家族蛋白的功能：
Bcl-2 家族蛋白是一群在粒線體膜上調控細胞凋亡途徑（特別是粒線體途徑）的蛋白質。牠們的功能主要是決定細胞是否進入凋亡，扮演著「守門員」或「調節者」的角色。該家族蛋白的成員具有不同的功能，可分為促凋亡（pro-apoptotic）和抗凋亡（anti-apoptotic）兩大類。

• 抗凋亡成員 (Anti-apoptotic members)： 如 Bcl-2、Bcl-xL。牠們能夠結合並抑制促凋亡成員（特別是 Bax、Bak）的活性，阻止 Bax/Bak 在粒線體外膜形成孔洞，從而阻止細胞色素 C（cytochrome c）等促凋亡因子的釋放，阻

此題考驗對細胞膜運輸機制及其相關蛋白質的理解。細胞膜的選擇性滲透性是維持細胞內外環境穩態的關鍵，而各種運輸蛋白則在此過程中扮演核心角色。

核心觀念： 細胞膜運輸機制可分為被動運輸（不需能量）和主動運輸（需能量），兩者都依賴特定的膜蛋白來完成。

詳解：

細胞膜運輸物質的機制主要有以下幾類：

1. 被動運輸 (Passive Transport)：
   此類運輸不消耗細胞的能量（ATP），而是利用物質本身的濃度梯度或電化學梯度進行移動。

   • 單純擴散 (Simple Diffusion)：

     • 機制： 小型、非極性分子（如 $O_2$, $CO_2$, 脂溶性分子）可直接穿過脂雙層膜，從高濃度區域移動到低濃度區域。
     • 參與蛋白質： 無。
     • 範例： 氧氣進入細胞，二氧化碳離開細胞。

   • 促進擴散 (Facilitated Diffusion)：

     • 機制： 離子、極性分子或較大分子（如葡萄糖、胺基酸、離子）無法直接穿過脂雙層，需要膜上的蛋白質協助才能跨越膜。此過程仍順著濃度梯度進行，不消耗 ATP。
     • 參與蛋白質：
       • 通道蛋白 (Channel Proteins)： 形成親水性通道，允許特定離子或小分子通過。通道蛋白具有選擇性，例如離子通道（如鉀離子通道 $K^+$ channel, 鈉離子通道 $Na^+$ channel）僅允許特定離子通過。水通道蛋白（Aquaporins）則專門輸送水分子。
       • 載體蛋白 (Carrier Proteins)： 結合特定的溶質分子，改變構形，將溶質從膜的一側運送到另一側。它們的運輸速率有飽和現象，因為蛋白質數量有限。
     • 範例：
       • 葡萄糖的運輸（透過葡萄糖轉運蛋白 GLUTs）。
       • 離子（如 $Na^+$, $K^+$, $Ca^{2+}$）通過離子通道。
       • 水的運輸（透過水通道蛋白 Aquaporins）。

2. 主動運輸 (Active Transport)：
   此類運輸需要消耗細胞能量（通常是 ATP 水解），以將物質從低濃度區域逆濃度梯度運輸到高濃度區域。

   • 機制： 依賴細胞膜上的「幫浦蛋白」(Pumps) 或「轉運蛋白」(Transporters)，這些蛋白質直接消耗能量來移動物質。
   • 參與蛋白質：
     • 幫浦蛋白 (Pumps)：

此題要求解釋四種重要的分子生物學與細胞生物學技術，並舉例說明其應用。這四種技術涵蓋了基因編輯、顯微成像和基因調控，是現代生命科學研究的基石。

核心觀念： 理解各種技術的基本原理、關鍵組件以及如何在實驗中應用以解決生物學問題。

詳解：

i. CRISPR-Cas9

• 原理： CRISPR-Cas9 是一種基因編輯技術，源自細菌的適應性免疫系統。它利用一個 guide RNA (gRNA) 來引導 Cas9 核酸酶到目標 DNA 序列，Cas9 酶會在目標位點切割雙股 DNA。細胞的 DNA 修復機制會嘗試修復這個斷裂，這個過程可以被利用來進行基因的敲除（透過非同源末端連接 NHEJ，常引入突變導致基因失活）或基因的插入/替換（透過同源重組 HDR，在斷裂處插入外源 DNA 模板）。
• 應用範例：
  1. 基因功能研究： 在細胞株或模式生物（如斑馬魚、小鼠）中精確地敲除特定基因，以研究該基因在細胞生長、分化、疾病發生等過程中的功能。例如，敲除腫瘤抑制基因 TP53，觀察其對細胞增殖和凋亡的影響。
  2. 開發基因療法： 針對遺傳性疾病，利用 CRISPR-Cas9 校正致病基因的突變。例如，在研究利用 CRISPR-Cas9 編輯 β-珠蛋白基因，以治療鐮刀型紅血球貧血症。

ii. Super-resolution microscopy (超解析度顯微鏡)

• 原理： 傳統的光學顯微鏡受到瑞利判據 (Rayleigh criterion) 的限制，解析度約為 200-300 奈米 (nm)，無法分辨更小的結構。超解析度顯微鏡技術（如 STED, PALM, STORM）透過各種物理或化學方法，繞過傳統光的繞射極限，達到數十奈米的解析度，甚至能分辨單一分子。這些技術通常利用特定分子（如螢光分子）在特定時間的開關（on/off）狀態，或利用激發和偵測光束的空間限制來實現。
• 應用範例：
  1. 細胞器結構與分子定位： 解析細胞內微細結構，如突觸（synapse）的蛋白質組成與分佈、細胞核的染色質結構、細胞膜受體的精確定位。例如，利用 STORM 顯微鏡觀察細胞膜上特定受體（如 GPCRs）的聚集情況及其與配體的交互作用。
  2. 蛋白質複合物的動態研究： 追蹤細胞內蛋白質複合物的形成、解離和在細胞內的移動。例如，利用 PALM 顯微鏡觀察細胞骨架蛋白（如肌動蛋白）動態聚合和解聚的過程，以及其在細胞運動中的作用。

iii. Gene silencing (基因沉默)

• 原理： 基因沉默是指降低或關閉特定基因的表現，使其無法轉譯成蛋白質。這可以發生在轉錄層級（抑制轉錄）或轉譯層級（抑制轉譯）。
• 常見技術：

此題要求描述八種不同蛋白質或蛋白質複合物的功能。這涵蓋了細胞黏附、訊號傳遞、細胞運輸、離子通道、醣類代謝、細胞週期調控等多個重要面向。

核心觀念： 了解這些關鍵分子在細胞內扮演的角色及其作用機制。

詳解：

i. Integrin

• 功能： Integrins 是一類細胞表面的跨膜受體蛋白，主要功能是介導細胞與細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 之間的黏附，同時也能參與細胞與細胞之間的黏附。牠們是細胞外基質的受體，能識別 ECM 中的特定分子（如膠原蛋白、纖維連結蛋白）。Integrins 在細胞內側與細胞骨架蛋白（如肌動蛋白）結合，形成黏著斑 (focal adhesions)，將 ECM 的訊號傳遞到細胞內部，影響細胞的形態、遷移、增殖、分化和存活。
• 作用機制： Integrins 通常以異二聚體 (heterodimer) 的形式存在，由 $\alpha$ 和 $\beta$ 亞基組成。其活性受到細胞內外因素的調控，表現出「雙向訊號傳遞」(bidirectional signaling) 的特性，即外界訊號可透過 integrin 傳入細胞，細胞內的訊號也可調控 integrin 的構形和結合能力。

ii. Ras

• 功能： Ras 是一類小 G 蛋白 (small GTPase)，是細胞內重要的 GTP 結合蛋白，在細胞訊號傳遞中扮演關鍵角色，特別是介導由生長因子受體傳來的訊號。Ras 蛋白在處於 GTP 結合狀態時是活化的，能夠啟動下游的訊號傳遞通路，如 MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) 途徑，進而調控細胞的增殖、分化、存活和遷移。在 GDP 結合狀態時，Ras 處於非活性狀態。Ras 的活性受到 GTP 酶活化蛋白 (GAP) 的促進失活，以及 GTP 結合蛋白相關蛋白 (GEF) 的促進活化。
• 作用機制： Ras 蛋白在細胞膜上，透過其與 GTP/GDP 的結合狀態，像一個分子開關，將來自細胞外訊號（如生長因子）傳遞到細胞內部，啟動一系列下游的訊號級聯反應。

iii. Kinesin

• 功能： Kinesins 是一類馬達蛋白 (motor proteins)，主要功能是在微管 (microtubules) 上介導貨物的運輸。牠們利用 ATP 水解提供的能量，沿著微管的極性方向（通常是從細胞的負極端向正極端，即從細胞中心向細胞周邊）移動，將各種貨物（如囊泡、細胞器、蛋白質複合物、mRNA）運輸到細胞的不同區域。
• 作用機制： Kinesin 分子通常包含馬達結構域（與微管和 ATP 結合）、頸部結構域和貨物結合結構域。透過 ATP 的水解循環，Kinesin 分子會發生構形改變，實現沿微管的「行走」運動。

iv. Voltage-gated Na+ channel (電壓閘控鈉離子通道)

• 功能： 這是細胞膜上的離子通道蛋白，對電壓變化敏感。牠們在神經元和肌肉細胞的興奮性膜（如神經軸突、肌肉細胞膜）中扮演關鍵角色。當膜電位達到閾值時，這些通道會快速打開，允許大量的鈉離子 ($Na^+$) 從細胞外流入細胞內，引起膜電位的快速去極化，這是動作電位 (action potential) 發生的基礎。
• 作用機制： 通道蛋白包含一個或多個對電壓敏感的結構域，當膜電位改變時，這些結構域會引起通道構形變化，從關閉狀態轉變為開啟狀態。一旦通道開啟，鈉離子會順著其電化學梯度快速通過。隨後，通道會迅速失活（inactivate），阻止鈉離子進一步流入，為下一次去極化做準備。

v. Sialyl-transferase (唾液酸轉移酶)

• 功能： 唾液酸轉移酶是一類參與醣鏈 (glycan) 合成和修飾的酵素。牠們負責將唾液酸 (sialic acid) 殘基轉移到醣鏈的末端，通常是轉移到一個醣蛋白或醣脂的末端半乳糖或 N-乙醯葡萄糖胺殘基上。