113 年 國立臺灣大學生命科學研究所《分子與細胞生物學》

核心觀念： 酪胺酸激酶受體 (Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 是一類重要的細胞表面受體，在細胞生長、分化、代謝及存活等過程中扮演關鍵角色。

詳解：
受體酪胺酸激酶 (Receptor Tyrosine Kinase, RTK) 是一類位於細胞膜上的膜蛋白，其胞外區域負責結合特定的生長因子或激素，而胞內區域則具有酪胺酸激酶活性。當配體（如生長因子）與 RTK 的胞外結構域結合後，會誘導 RTK 發生二級體形成 (dimerization)，進而啟動其胞內激酶域的活性，並對其自身或細胞內其他蛋白質的酪胺酸殘基進行磷酸化。

功能：

1. 信號傳導起始： RTKs 是許多細胞外信號（如生長因子、細胞因子）進入細胞內的主要媒介。配體結合是啟動下游信號級聯的關鍵第一步。

核心觀念： 核小體 (Nucleosome) 是真核生物 DNA 緊密包裝的基本結構單位，對於 DNA 的組織、基因表現調控以及 DNA 的其他功能（如複製、修復）都至關重要。

詳解：
核小體 (Nucleosome) 是真核生物染色質的基本結構單位。一個核小體由約 147 個鹼基對的 DNA 雙股螺旋纏繞在一個蛋白質核心周圍所構成。這個蛋白質核心由四種組蛋白 (histone) 各兩個所組成，即 H2A、H2B、H3 和 H4，形成一個八聚體 (histone octamer)。DNA 雙股螺旋以約 1.65 圈的超螺旋方式緊密纏繞在組蛋白八聚體上。在核小體之間，DNA 鏈是開放的，並可能與另一種組蛋白 H1 結合，進一步協助 DNA 的壓縮。

核心觀念： 胞間連絲 (Plasmodesmata) 是植物細胞之間進行直接細胞質連接的通道，在植物組織中實現物質和信號的跨細胞運輸。

詳解：
胞間連絲 (Plasmodesmata) 是存在於相鄰植物細胞細胞壁之間的微小通道。每個胞間連絲是由細胞膜內襯的細胞壁穿孔構成，允許兩個細胞的細胞質直接連通。通常，內質網的某些部分也會穿過胞間連絲，形成稱為「柄狀內質網」的結構，這表明胞間連絲的形成與細胞的內質網系統密切相關。

功能：

1. 物質運輸： 胞間連絲允許小分子（如離子、糖類、氨基酸、核苷酸、ATP）和部分大分子（如 RNA、蛋白質）在植物細胞之間直接運輸，實現細胞間的營養供應和代謝協調。

核心觀念： 吞噬作用 (Phagocytosis) 是一種細胞攝取大顆粒物質（如微生物、細胞碎片）的內吞作用機制，是免疫系統清除病原體和細胞殘骸的重要方式。

詳解：
吞噬作用 (Phagocytosis) 是細胞外吞作用 (endocytosis) 的一種形式，其中細胞通過形成細胞膜的突起（稱為偽足，pseudopods）來包圍和吞噬較大的外來顆粒，如細菌、真菌、病毒、細胞碎片、凋亡細胞等。一旦顆粒被包裹，它就會被包含在一個稱為吞噬體 (phagosome) 的膜結合囊泡中，該囊泡隨後會與溶酶體 (lysosome) 融合，形成吞噬溶酶體 (phagolysosome)。在吞噬溶酶體內，來自溶酶體的酶和活性氧物質會降解吞噬的顆粒。

核心觀念： 主要組織相容性複合體第二類分子 (MHC class II) 是一種在抗原呈獻細胞 (APC) 上表達的蛋白質，負責呈獻外源性抗原給輔助型 T 細胞 (helper T cells)，是啟動適應性免疫反應的關鍵。

詳解：
主要組織相容性複合體第二類分子 (MHC class II) 是一類位於抗原呈獻細胞（如巨噬細胞、樹突狀細胞、B 細胞）表面細胞膜上的異二聚體蛋白質（由 $\alpha$ 鏈和 $\beta$ 鏈組成）。MHC class II 分子主要參與呈獻由細胞外來源（外源性）的抗原片段。細胞吞噬外來物質（如細菌）後，在吞噬體內將其分解成肽段，這些肽段隨後與在內質網中合成並經過處理的 MHC class II 分子結合。結合了抗原肽段的 MHC class II 分子隨後被運輸到細胞表面，在那裡可以被輔助型 T 細胞（CD4$^+$ T cells）識別。

核心觀念： CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是一種源自細菌和古細菌的適應性免疫系統，在基因工程領域已發展成為強大的基因編輯工具。

詳解：
CRISPR 系統最初是在細菌和古細菌中發現的一種適應性免疫機制，用於抵抗病毒（噬菌體）和其他外來遺傳物質。該系統通過將外來 DNA 片段整合到細菌基因組的 CRISPR 區域，形成「記憶」片段。當相同的外來 DNA 再次入侵時，CRISPR 系統會轉錄這些記憶片段形成 RNA 分子，並與 Cas (CRISPR-associated) 蛋白協同作用，識別並切割外來 DNA，從而保護細菌。

在基因工程中，CRISPR-Cas9 系統是最廣泛使用的基因編輯工具。它包含兩個關鍵組件：

1. 嚮導 RNA (guide RNA, gRNA)： 一段人造 RNA 分子，結合了 CRISPR 記憶序列和 Cas9 識別外來 DNA 的序列。gRNA 指導 Cas9 蛋白定位到目標 DNA 序列。
2. Cas9 蛋白： 一種核酸酶，在 gRNA 的引導下，能夠在目標 DNA 序列處產生雙鏈斷裂 (double-strand break, DSB)。

核心觀念： 抑癌基因 (Tumor Suppressor Gene) 是細胞內負責抑制細胞生長、防止細胞癌變的基因。當這些基因發生突變失活時，細胞的生長和分裂可能失控，增加罹患癌症的風險。

詳解：
抑癌基因 (Tumor Suppressor Gene) 在正常細胞中扮演著「煞車」的角色，它們的蛋白質產物負責調控細胞週期、修復 DNA 損傷、誘導細胞凋亡（程式性細胞死亡）或抑制細胞增殖，從而阻止細胞不受控制地生長和分裂。

抑癌基因的功能主要體現在以下幾個方面：

1. 細胞週期檢查點控制： 許多抑癌基因的產物（如 p53, pRB）是細胞週期檢查點的關鍵調節因子，確保 DNA 在進入下一個細胞週期階段前得到準確複製和修復。
2. DNA 修復： 一些抑癌基因（如 BRCA1, BRCA2）參與 DNA 損傷的檢測和修復機制，防止突變累積。

核心觀念： 多聚腺苷酸化信號 (Polyadenylation signal) 是真核生物 mRNA 前驅體 (pre-mRNA) 3' 端加工中的一個關鍵序列，標誌著 mRNA 剪接和多聚腺苷酸尾鏈 (poly(A) tail) 添加的位置。

詳解：
多聚腺苷酸化信號 (Polyadenylation signal)，在哺乳動物中通常是 AAUAAA 或類似序列，位於真核生物 mRNA 前驅體 (pre-mRNA) 的 3' 非轉譯區 (3' untranslated region, 3' UTR)。它是一個 RNA 序列，在轉錄完成後，由特定的蛋白質複合物（包括 CPSF, Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor；CstF, Cleavage Stimulation Factor；以及 PABP, Poly(A)-binding protein）識別。

這個信號序列的作用是：

1. 標記剪切位點： CPSF 識別 AAUAAA 序列，並招募其他剪切因子，在該序列下游約 10-30 個核苷酸處精確地剪切 pre-mRNA。

核心觀念： Western blotting（蛋白質印跡法）是一種檢測特定蛋白質在蛋白質樣品中是否存在及其相對數量的實驗技術，廣泛應用於生物化學和分子生物學研究。

詳解：
Western blotting (也稱為 immunoblotting) 是一種多步驟的實驗技術，用於檢測蛋白質樣品中是否存在特定目標蛋白質。其基本流程如下：

1. 蛋白質樣品製備： 從細胞或組織中提取蛋白質，並進行變性處理。
2. 蛋白質電泳： 將蛋白質樣品通過凝膠電泳（通常是 SDS-PAGE，即十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳）分離。SDS-PAGE 根據蛋白質的分子量大小進行分離，帶負電的蛋白質向正極移動。
3. 蛋白質轉移（印跡）： 將在凝膠中分離好的蛋白質轉移到一個固體載體膜上（通常是硝酸纖維素膜或 PVDF 膜）。這樣可以使蛋白質更容易被抗體檢測。
4. 封閉： 使用非特異性蛋白質（如脫脂奶粉或 BSA）處理膜，以封閉膜上未結合蛋白質的位點，防止後續抗體與膜非特異性結合。
5. 一抗孵育： 加入針對目標蛋白質的特異性一級抗體 (primary antibody) 孵育膜。一抗會結合到目標蛋白質上。

核心觀念： 旁分泌 (Paracrine) 是一種細胞信號傳導方式，其中細胞釋放的信號分子作用於鄰近的細胞。

詳解：
旁分泌 (Paracrine) 是一種細胞間信號傳導模式。在这种模式中，一個細胞分泌的信號分子（如生長因子、細胞因子）僅在局部環境中擴散，作用於其鄰近的靶細胞，而不是通過血液循環到達全身（內分泌）或作用於自身（自分泌）。

機制：

1. 信號分子釋放： 信號細胞通過胞吐作用或其他機制釋放信號分子。
2. 局部擴散： 信號分子在細胞外基質中擴散，其濃度在距離信號細胞越遠的地方越低。
3. 靶細胞識別： 鄰近的靶細胞具有能識別並結合這些信號分子的受體。
4. 信號轉導： 受體結合信號分子後，啟動細胞內的信號轉導通路，引起靶細胞的特定生理反應。

核心觀念： 驅動蛋白 (Dynein) 是一種馬達蛋白 (motor protein)，能夠利用 ATP 水解產生的能量，沿著微管 (microtubule) 移動，在細胞內運輸貨物和產生力。

詳解：
驅動蛋白 (Dynein) 是一類大型蛋白質複合體，它們是細胞內重要的分子馬達。與驅動蛋白 (kinesin) 主要沿著微管的「正向」（外周方向）移動不同，驅動蛋白主要沿著微管的「負向」（向微管組織中心 MTOC 方向）移動。

驅動蛋白複合體通常包含重鏈 (heavy chains)、中間鏈 (intermediate chains) 和輕鏈 (light chains)。重鏈包含 ATP 酶活性位點和微管結合域，是驅動蛋白移動和產生力的主要部分。

核心觀念： 膜電位 (Membrane potential) 是細胞膜內外兩側由於離子分佈不均而產生的電位差，對於細胞的許多基本功能，特別是神經細胞和肌肉細胞的興奮性至關重要。

詳解：
膜電位 (Membrane potential) 是指細胞膜內側與外側之間存在的電位差。這種電位差的產生主要歸因於以下幾個因素：

1. 離子濃度梯度： 細胞內外各種離子（如 Na$^+$, K$^+$, Cl$^-$, Ca$^{2+}$）的濃度梯度不同，這是通過離子通道和離子泵（如 Na$^+$/K$^+$ ATP 酶）維持的。
2. 離子選擇性通透性： 細胞膜上的離子通道對不同離子的通透性不同。在靜息狀態下，鉀離子通道通常具有較高的通透性，使得鉀離子傾向於流出細胞，導致細胞內帶負電。
3. 電化學梯度： 離子跨膜移動時，受到電場力和濃度梯度的共同作用（即電化學梯度）。

核心觀念： 第二信使 (Second messengers) 是細胞內的小分子物質，它們在細胞膜受體激活後，將來自細胞外信號的訊息傳遞到細胞內部，啟動下游的細胞反應。

詳解：
在真核生物的細胞信號傳導途徑中，細胞外信號分子（第一信使，如激素、神經遞質）結合到細胞膜上的受體後，並不能直接進入細胞內部執行功能。取而代之的是，受體激活後會觸發細胞內一系列的事件，其中一個關鍵步驟是產生或釋放稱為「第二信使」的小分子。這些第二信使在細胞質內擴散，並與細胞內的特定目標蛋白質（如激酶、離子通道、轉錄因子）結合，從而放大和轉導最初的細胞外信號，最終引起細胞的特定生理響應。

兩個範例及其功能：

1. 環磷酸腺苷 (cyclic AMP, cAMP)

• 產生機制： 當某些細胞外信號（如腎上腺素、升糖素）結合到 G 蛋白偶聯受體 (GPCR) 後，會激活細胞膜上的腺苷酸環化酶 (adenylyl cyclase)，該酶催化 ATP 轉化為 cAMP。
• 功能： cAMP 的主要功能是激活蛋白質激酶 A (protein kinase A, PKA)。PKA 是一種絲/蘇氨酸激酶，它能磷酸化細胞內的許多蛋白質，從而調控細胞代謝（如糖原分解）、基因表現、離子通道活性和細胞增殖等。

核心觀念： RNA 修飾是指在 RNA 分子合成後，通過酶促反應對 RNA 進行的化學修飾，這些修飾對於 RNA 的結構、穩定性、功能以及細胞內的調控至關重要。

詳解：
真核生物的 RNA 在轉錄後會經歷一系列的加工修飾，以形成成熟且具有功能的 RNA 分子。這些修飾涵蓋了 mRNA、tRNA、rRNA 等多種 RNA 類型，並且對 RNA 的穩定性、正確的折疊、與蛋白質的結合、核內運輸、翻譯效率以及調控基因表現等方面都起著關鍵作用。

兩個 RNA 修飾的範例及其重要功能：

1. 5' 端加帽 (5' capping)

• 修飾描述： 在真核生物 mRNA 的轉錄過程中，其 5' 端會被添加一個特殊的結構，即 7-甲基鳥苷 (7-methylguanosine, $m^7G$)，通過一個 5'-5' 三磷酸鍵連接到第一個核苷酸上。
• 重要功能：
  • 保護 mRNA 免受降解： 5' 加帽結構可以保護 mRNA 免受 5' 核酸酶的降解，從而增加 mRNA 的穩定性。
  • 促進 mRNA 的出核： 加帽結構是 mRNA 從細胞核運輸到細胞質所必需的信號。
  • 識別核醣體結合位點： 加帽結構能夠被細胞質中的 eIF4E (eukaryotic initiation factor 4E) 識別，這是起始核醣體結合到 mRNA 上進行翻譯的關鍵步驟。它確保了 mRNA 能夠有效地被翻譯成蛋白質。

2. 內含子剪接 (Intron splicing)

• 修飾描述： 真核生物的基因通常包含編碼區（外顯子, exons）和非編碼區（內含子, introns）。在 pre-mRNA 加工過程中，內含子會被精確地切除，而外顯子則被連接起來，形成成熟的 mRNA。這個過程稱為剪接。

核心觀念： 內共生學說 (Endosymbiotic Theory) 提出線粒體（以及葉綠體）起源於古代細菌被真核細胞吞噬後，形成了一種長期的共生關係，最終演變成細胞器。

詳解：
內共生學說認為，真核細胞的線粒體是由一個古老的細菌被一個較大的古菌或早期真核細胞吞噬後，經過長期的共生演化而來的。此學說得到了大量實驗證據的支持，以下是其中四項重要的支持證據：

1. 線粒體的 DNA 和核糖體與細菌相似

• 證據： 線粒體擁有自己的圓形 DNA 分子（mtDNA），其結構和基因組織與細菌的染色體相似，而非真核細胞的線性染色體。此外，線粒體內的核糖體（70S 型）在大小、組成和對抗生素的敏感性上，也與細菌的核糖體相似，而與真核細胞質中的核糖體（80S 型）不同。
• 解釋： 這表明線粒體具有獨立的遺傳物質和蛋白質合成系統，且其起源與細菌類似。

2. 線粒體的雙層膜結構

• 證據： 線粒體被兩層膜包圍。內膜（與線粒體基質直接接觸）的組成和蛋白質（如電子傳遞鏈複合物）在功能和結構上與某些細菌的細胞膜非常相似。外膜則更類似於真核細胞的內質網膜。
• 解釋： 雙層膜結構支持了線粒體是由一個被吞噬的細胞（內膜代表其原始細胞膜）被一個囊泡包裹（外膜代表吞噬細胞的膜）而形成的假說。

核心觀念： 蛋白質互作分析是研究蛋白質功能及其在細胞內扮演角色 (protein-protein interaction, PPI) 的關鍵步驟。本題要求設計實驗來鑑定某未知蛋白質 X 的互作夥伴。

詳解：
若要鑑定未知蛋白質 X 的互作夥伴，我會採用多種實驗方法，結合「發現性 (discovery-based)」和「驗證性 (validation-based)」的策略，以提高結果的準確性和可靠性。以下是我的實驗設計步驟：

實驗設計步驟：

第一階段：發現性實驗 (Discovery-based experiments) - 尋找潛在互作夥伴

我會優先考慮使用兩種主流的、能夠在細胞內或細胞外進行高通量篩選蛋白質互作的方法：

1. 酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid, Y2H) 實驗：

• 原理： Y2H 是一種在酵母細胞內篩選蛋白質-蛋白質互作的方法。它基於轉錄激活因子 (transcription factor) 的結構，將一個 DNA 結合域 (DNA-binding domain, DBD) 和一個轉錄激活域 (activation domain, AD) 分開。當目標蛋白質 X 的片段（通常是其全序列或推測的活性域）與 DBD 融合（作為「誘餌」，bait），另一個待測蛋白質的 cDNA 文庫（作為「獵物」，prey）與 AD 融合。若 X 與某個獵物蛋白質發生互作，則 DBD 和 AD 會被拉近，重新組合成一個功能性的轉錄因子，激活下游報告基因（如 HIS3, ADE2, lacZ）的表達，從而篩選出潛在互作夥伴。
• 設計：
  • 構建包含蛋白質 X 的 DBD 融合載體。
  • 篩選一個包含多個潛在互作蛋白質的 cDNA 文庫（例如，來自與 X 在同一組織或細胞類型中表達的文庫）。
  • 將文庫中的 cDNA 克隆到 AD 融合載體中。
  • 將 bait 和 prey 載體轉化到酵母細胞中。
  • 在選擇性培養基上培養，篩選出能夠在報告基因表達下生長的酵母菌落。
  • 通過 PCR 或測序鑑定這些菌落中與 AD 融合的 cDNA，從而獲得 X 的潛在互作夥伴列表。

2. 體外共免疫沉澱 (In vitro Co-Immunoprecipitation, Co-IP) 或細胞內免疫沉澱 (in vivo Co-IP)：

• 原理： Co-IP 是一種利用抗體特異性結合目標蛋白質，並將與之結合的其他蛋白質一同沉澱下來的方法。
  • 體外 Co-IP： 使用重組表達的純化蛋白質 X 和純化的潛在互作蛋白質，在體外混合，然後用抗 X 的抗體進行免疫沉澱，檢測是否能沉澱下潛在互作蛋白質。
  • 細胞內 Co-IP： 在表達蛋白質 X 的細胞（或轉染了 X 的細胞）裂解液中，使用抗 X 的抗體進行免疫沉澱，然後用 Western blotting 檢測沉澱物中是否存在潛在互作蛋白質。這種方法更貼近細胞內的生理環境。
• 設計：
  • 細胞內 Co-IP (推薦)：
    • 表達蛋白質 X 的細胞系（或轉染表達 X 的細胞）。
    • 使用針對蛋白質 X 的特異性抗體。
    • 將細胞裂解，加入抗體，然後用 Protein A/G 瓊脂糖珠或磁珠將免疫複合物沉澱下來。
    • 洗滌後，用 Western blotting 檢測沉澱物中是否存在其他蛋白質（可以先通過 Y2H 獲得的潛在列表，或者直接檢測細胞裂解液中豐富的蛋白質）。
  • 如果沒有合適的抗 X 抗體： 可以考慮表達帶有標籤（如 FLAG, HA, Myc）的蛋白質 X，然後使用抗標籤的抗體進行免疫沉澱。

第二階段：驗證性實驗 (Validation-based experiments) - 確認互作

從第一階段獲得的潛在互作夥伴列表中，需要通過獨立的實驗方法來驗證這些互作是否真實存在，以及它們在細胞內的生理意義。

3. 雙重免疫沉澱 (Reciprocal Co-Immunoprecipitation, Reciprocal Co-IP)

• 原理： 與單向 Co-IP 不同，Reciprocal Co-IP 是先用抗 X 的抗體沉澱，再用抗潛在互作夥伴的抗體沉澱（或反之），以獲得更強的驗證。