113 年 國立臺灣大學醫學檢驗暨生物技術學系碩士班（一般生）《分子生物學（C）》

DNA 複製的忠誠度（fidelity）是指 DNA 聚合酶（DNA polymerase）在複製過程中準確地將正確的核苷酸添加到新生鏈上的能力。為了確保遺傳資訊的準確傳遞，DNA 聚合酶採用了多種機制來防止錯誤的核苷酸被併入。

主要機制包括：

1. 校對（Proofreading）功能： 大部分 DNA 聚合酶都具有 3'→5' 核酸外酶（exonuclease）活性。當一個錯誤的核苷酸被錯誤地併入新生鏈時，DNA 聚合酶的活性中心會檢測到這種不匹配，然後利用其 3'→5' 核酸外酶活性將錯誤的核苷酸移除。移除後，DNA 聚合酶會嘗試重新添加正確的核苷酸。這個過程大大提高了複製的準確性。

2. 錯配修復（Mismatch Repair, MMR）系統： 儘管有校對功能，但仍可能會有極少數的錯配通過。

此題主要在考察 DNA 複製過程中各重要蛋白質的功能。

(a) Proliferating cell nuclear antigen (PCNA)
PCNA 是一個環狀的蛋白質，在真核細胞中，它作為 DNA 聚合酶的「夾子」（sliding clamp）。PCNA 與 DNA 聚合酶結合，形成一個穩定的複合物，增加 DNA 聚合酶在 DNA 模板上的結合力和滑動性，從而顯著提高 DNA 合成的速率和過程的穩定性。PCNA 的表現量在細胞增生旺盛的細胞中較高，因此得名。

(b) Replication protein A (RPA)
RPA 是真核細胞中的單鏈 DNA 結合蛋白（single-stranded DNA-binding protein, ssDNA-binding protein）。在 DNA 複製、修復和重組過程中，當雙鏈 DNA 被解開形成單鏈 DNA 後，RPA 會迅速結合到單鏈 DNA 上，以保護其免受核酸酶降解，防止單鏈 DNA 形成不穩定的二级結構，並為其他複製和修復蛋白質提供結合位點，啟動後續的複製或修復過程。

(c) helicase
Helicase 是一種解旋酶，它利用 ATP 水解提供的能量，破壞 DNA 雙螺旋結構中的氫鍵，使雙鏈 DNA 分離成單鏈。在 DNA 複製中，DNA 解旋酶（如 DnaB 在原核，MCM 複合體在真核）在複製叉處解開 DNA，提供單鏈模板供 DNA 聚合酶合成新的 DNA 鏈。

(d) DNA topoisomerase
DNA 拓樸異構酶（DNA topoisomerase）在 DNA 複製、轉錄和重組過程中至關重要。

此題考查了兩種主要的 DNA 修復系統：錯配修復（Mismatch Repair, MMR）和鹼基切除修復（Base Excision Repair, BER）。

(a) MSH2/MSH6, MLH1/PMS1
MSH2/MSH6 和 MLH1/PMS1 是錯配修復（Mismatch Repair, MMR）系統中的關鍵蛋白質。

• 功能： MMR 系統主要負責識別並修復 DNA 複製過程中產生的鹼基錯配（mismatch）和微小插入/缺失（indel）。
• 作用機制：
  1. 識別錯配： MSH2/MSH6 複合體（在原核中為 MutS 同源物）識別 DNA 鏈上的鹼基錯配或微小插入/缺失。
  2. 招募修復酶： 識別後，MSH2/MSH6 會招募 MLH1/PMS1 複合體（在原核中為 MutL 同源物）以及其他修復蛋白質（如 PCNA, RFC, DNA 聚合酶 $\delta$/$\epsilon$, Exo I/II 或 FEN1）。
  3. 切除錯誤片段： MLH1/PMS1 複合體協助決定哪條 DNA 鏈（通常是新生鏈）含有錯誤，然後通過核酸外酶（exonuclease）活性切除錯誤的鹼基及其周圍的一段 DNA。
  4. 重新合成： DNA 聚合酶利用正確的模板鏈重新合成被切除的 DNA 片段。
  5. 連接： DNA 連接酶（ligase）將新合成的 DNA 片段連接起來。

MSH2/MSH6 複合體是錯配識別的關鍵，而 MLH1/PMS1 複合體則在啟動下游的切除和修復通路中起核心作用。

此題考查基因轉錄（transcription）的相關分子和元件。需要辨識哪些是轉錄過程必需的，並描述其功能。

與基因轉錄相關的元素及其功能：

• (b) RNA polymerase: 這是轉錄過程的核心酶。它負責識別 DNA 的啟動子（promoter）區域，解開 DNA 雙螺旋，並以 DNA 為模板，按照鹼基互補配對原則，合成一條 RNA 分子。

• (e) Promoter: 啟動子是位於基因上游（5'端）的一段特定 DNA 序列，是 RNA 聚合酶識別並結合的位點，它決定了轉錄的起始位置和頻率。

• (g) Transcription factors: 轉錄因子是蛋白質，它們能夠結合到 DNA 的特定序列（如啟動子、增強子 enhancer 或沉默子 silencer）上，調節 RNA 聚合酶的活性，從而控制基因的轉錄速率。它們可以是正調控因子（activators）或負調控因子（repressors）。

與基因轉錄間接相關或不直接相關的元素：

• (a) DNA polymerase: DNA 聚合酶主要參與 DNA 複製，而非 RNA 的轉錄。

此題考查真核生物 pre-mRNA 的兩種重要轉錄後修飾（post-transcriptional modification）的目的。

5' Capping (5' 帽狀結構修飾)

• 目的：
  1. 保護 mRNA 免於降解： 在 5' 端加上一個特殊的 7-甲基鳥苷（7-methylguanosine, m$^7$G）核苷酸，通過一個特殊的 5'-5' 三磷酸鍵連接。這個結構能保護 mRNA 免於 5' 端核酸外酶（exonucleases）的降解，延長 mRNA 的穩定性。
  2. 促進 mRNA 運輸： 幫助成熟的 mRNA 從細胞核運輸到細胞質。
  3. 識別參與轉譯： 在細胞質中，5' 帽狀結構是核糖體（ribosome）識別並結合的位點，是啟動蛋白質合成（轉譯）的關鍵信號。

3' Polyadenylation (3' poly(A) 尾巴修飾)

• 目的：

此題考查 RNA 剪接（RNA splicing）的概念、必要性以及剪接異常的後果。

RNA 剪接 (RNA Splicing) 的定義：
RNA 剪接是真核生物基因轉錄後對 pre-mRNA 進行的一種重要的 RNA 加工過程。在這個過程中，pre-mRNA 分子中的非編碼區段（內含子, introns）會被精確地移除，而編碼區段（外顯子, exons）則會被連接起來，形成成熟的 mRNA 分子。這個過程主要由一個大型的蛋白質-RNA 複合體——剪接體（spliceosome）催化完成。

高等生物體內需要 RNA 剪接機制的原因：

1. 增加蛋白質的多樣性（Alternative Splicing）： 這是 RNA 剪接在高等生物體中最重要的意義之一。通過選擇性地組合不同的外顯子，一個單一的基因可以產生多種不同的 mRNA 分子，進而編碼出結構和功能各異的蛋白質。這種「可變剪接」（alternative splicing）極大地擴展了基因組編碼蛋白質的種類，是生物體複雜性的重要來源。
2. 調控基因表現： 剪接也可以作為一種基因表現調控的機制。
3. 排除非編碼區： 內含子本身通常不編碼蛋白質，移除它們是為了獲得正確的編碼序列。

核心觀念

本題考查三個重點：

1. DNA、RNA 與蛋白質之間的互補與轉譯關係。
2. DNA 序列中單一鹼基插入所造成的「移碼突變」（frameshift mutation）。
3. 真核生物基因定序時，必須確認 DNA 鏈的方向、讀框、剪接狀態與序列完整性。

題目中的 Reference gene X DNA 為：

$$5'-\mathrm{GAT\ CGT\ ACA\ TAT\ A}-3'$$

其 RNA 為：

$$5'-\mathrm{GAU\ CGU\ ACA\ UAU\ A}-3'$$

但此 RNA 若直接視為 coding strand 轉錄產物，將會翻譯成：

$$\mathrm{GAU\ CGU\ ACA\ UAU} \rightarrow \mathrm{Asp\ Arg\ Thr\ Tyr}$$

與題目給定的蛋白質 $\mathrm{Leu\ Ala\ Cys\ Ile}$ 不符。因此，題目中的 Reference gene X DNA 應理解為 template strand，RNA 是其互補序列。實際轉譯所使用的 mRNA 應為：

$$5'-\mathrm{CUA\ GCA\ UGU\ AUA}-3'$$

其胺基酸為：

$$\mathrm{CUA\ GCA\ UGU\ AUA} \rightarrow \mathrm{Leu\ Ala\ Cys\ Ile}$$

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解題方法

1. 先比對 Reference 與 Cloned DNA

Reference gene X DNA：

$$\mathrm{GAT\ CGT\ ACA\ TAT\ A}$$

Cloned gene X DNA：

$$\mathrm{GAT\ GCG\ TAC\ ATA\ TA}$$

將兩者對齊：

Reference：GAT  CGT  ACA  TAT  A
Cloned　：GAT  GCG  TAC  ATA  TA
　　　　　　 ↑
　　　　　多出一個 G

Cloned gene X 在原本的 GAT 之後多插入一個 G，因此不是正確的 gene X 序列。

這不是單純的鹼基置換，而是：

$$\boxed{\text{單一鹼基插入突變}}$$

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2. 判斷是否造成移碼

一個 codon 由 3 個核苷酸組成。若插入或刪除的核苷酸數不是 3 的倍數，便會改變插入點後所有 codon 的分組方式。

本題插入 1 個鹼基：

$$1 \not\equiv 0 \pmod 3$$

因此會造成 reading frame 改變，即移碼突變。

以 template strand 的互補序列表示：

Reference template DNA：

$$\mathrm{GAT\ CGT\ ACA\ TAT}$$

對應 mRNA：

$$\mathrm{CUA\ GCA\ UGU\ AUA}$$

翻譯為：

$$\mathrm{Leu\ Ala\ Cys\ Ile}$$

Cloned template DNA：

$$\mathrm{GAT\ GCG\ TAC\ ATA\ TA}$$

其互補 mRNA 為：

$$\mathrm{CUA\ CGC\ AUG\ UAU\ AU}$$

若仍從原本的讀框開始分組：

$$\mathrm{CUA\ CGC\ AUG\ UAU\cdots}$$

翻譯結果變成：

$$\mathrm{Leu\ Arg\ Met\ Tyr\cdots}$$

插入點之後的所有胺基酸序列都會改變，直到遇到新的終止密碼子為止。

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這個基因能否轉譯出正確蛋白質？

不能。

此題考查基因表現抑制（gene knockdown）和基因剔除（gene knockout）的分子生物學技術及其應用。

目標： 降低癌細胞中 gene Y 的表現量，以研究其對癌細胞生長的影響。

方法：

(一) 基因表現抑制 (Knockdown)：
Knockdown 指的是暫時性地、部分地降低目標基因的 mRNA 或蛋白質表現量。

1. RNA 干擾 (RNA Interference, RNAi)：

   • 原理： 利用小干擾 RNA (small interfering RNA, siRNA) 或短髮夾 RNA (short hairpin RNA, shRNA)。siRNA 或 shRNA 會與目標基因的 mRNA 結合，並誘導 RISC (RNA-induced silencing complex) 複合體將 mRNA 切割降解，從而降低目標蛋白質的合成。
   • 操作：
     • 設計並合成針對 gene Y mRNA 序列特異性的 siRNA 或 shRNA。
     • 將 siRNA 或 shRNA 導入癌細胞。導入方式可以是：
       • 轉染 (transfection)： 使用脂質體（liposome）、電穿孔（electroporation）等方法將合成的 siRNA 或 shRNA 分子直接導入細胞。
       • 慢病毒載體 (lentiviral vector) 感染： 將編碼 shRNA 的慢病毒載體導入細胞。這種方法可以產生穩定表達 shRNA 的細胞系，達到較持久的 knockdown 效果。
   • 優點： 操作相對簡單，可以快速看到效果，且相對特異性較高。
   • 缺點： 效果是暫時性的，且抑制程度可能不完全。

2. 反義寡核苷酸 (Antisense Oligonucleotides, ASOs)：

   • 原理： 設計一段與 gene Y mRNA 序列互補的寡核苷酸（DNA 或 RNA 類似物），使其能夠結合到目標 mRNA 上，通過阻斷翻譯、誘導 mRNA 降解（依賴 RNase H 活性）或影響剪接等方式來抑制表現。
   • 操作： 將設計好的 ASOs 導入細胞。
   • 優點： 設計靈活，可針對特定序列。
   • 缺點： 進入細胞的效率和穩定性可能受限，可能引起脫靶效應。

(二) 基因剔除 (Knockout)：
Knockout 指的是永久性地、完全地使目標基因失活。

1. CRISPR/Cas9 基因編輯技術：
   • 原理： 這是一種目前最常用且高效的基因編輯技術。系統包含一個 Cas9 核酸酶和一個引導 RNA (guide RNA, gRNA)。gRNA 會引導 Cas9 蛋白到目標基因 Y 的特定 DNA 位置，Cas9 蛋白在此處切割 DNA 雙鏈。細胞會嘗試修復這個 DNA 斷裂，但修復過程（特別是非同源末端連接, Non-homologous end joining, NHEJ）很容易引入小片段的插入或缺失（indels）。這些 indels 會導致讀碼框移位，產生截短的蛋白質，從而使基因失活。
   • 操作：
     • 設計針對 gene Y 的 gRNA。
     • 將編碼 Cas9 蛋白的質體（或 Cas9 蛋白本身）和 gRNA 一起導入癌細胞。
     • 篩選出成功發生基因剔除的細胞。
   • 優點： 高效、準確，可以實現永久性的基因失活。

此題考查蛋白質合成（轉譯, translation）過程中的基本組成和要素。蛋白質合成是一個複雜的過程，需要多種分子參與，但其核心要素可以歸納為以下四個主要部分。

蛋白質合成（轉譯）的核心四種元素：

1. mRNA (messenger RNA)： 作為模板，攜帶來自 DNA 的遺傳密碼。mRNA 的密碼子（codons）決定了蛋白質的氨基酸序列。
2. tRNA (transfer RNA)： 作為適配者分子（adaptor molecule）。每個 tRNA 分子的一端帶有特定的氨基酸，另一端帶有與 mRNA 密碼子互補的反密碼子（anticodon）。tRNA 將正確的氨基酸帶到核糖體上。
3. 核糖體 (Ribosome)： 蛋白質合成的場所。它是一個由 rRNA（核糖體 RNA）和蛋白質組成的複合體，包含小亞基（small subunit）和大亞基（large subunit）。核糖體提供 mRNA 和 tRNA 結合的位點，並催化肽鍵的形成。
4. 氨基酸 (Amino Acids)： 蛋白質的基本組成單位。

此題考查真核生物與原核生物在蛋白質轉譯（translation）過程中的比較。兩者在基本原理上相似，但在細節上存在顯著差異。

轉譯的基本過程 (相似之處)：
無論是原核還是真核生物，轉譯的核心步驟都包括：

1. 起始 (Initiation)： 核糖體小亞基結合到 mRNA 上，尋找起始密碼子 (AUG)，並與帶有起始氨基酸 (原核為甲醯甲硫胺酸 fMet，真核為甲硫胺酸 Met) 的起始 tRNA 結合，然後大亞基結合形成完整的起始複合物。
2. 延長 (Elongation)： 核糖體沿著 mRNA 移動，逐一識別 mRNA 的密碼子，並通過 tRNA 將對應的氨基酸帶到核糖體上，形成肽鍵，延長多肽鏈。這個過程涉及 A 位點 (aminoacyl site)、P 位點 (peptidyl site) 和 E 位點 (exit site)。
3. 終止 (Termination)： 當核糖體遇到 mRNA 上的終止密碼子 (UAA, UAG, UGA) 時，釋放因子 (release factor) 結合，導致多肽鏈從 tRNA 上釋放，核糖體亞基分離，mRNA 被釋放。

主要差異 (異)：

特徵	原核生物 (Prokaryotes)	真核生物 (Eukaryotes)
mRNA 的結構	通常為多順反子 (polycistronic) mRNA，即一個 mRNA 可編碼多個蛋白質。	通常為單順反子 (monocistronic) mRNA，一個 mRNA 只編碼一個蛋白質。
轉錄與轉譯的偶聯	轉錄和轉譯是偶聯的 (coupled)，即 mRNA 合成尚未完成時，核糖體就已開始進行轉譯。	轉錄在細胞核內進行，mRNA 加工 (加帽、剪接、加尾) 後才運輸到細胞質進行轉譯。轉錄和轉譯是分離的 (spatially and temporally separated)。
起始密碼子	AUG，但編碼的起始氨基酸是甲醯甲硫胺酸 (fMet)。	AUG，編碼的起始氨基酸是甲硫胺酸 (Met)。
起始因子	通常需要 3 個起始因子 (IF-1, IF-2, IF-3)。	通常需要 9-12 個起始因子 (eIFs)，過程更複雜。

此題考查 Internal Ribosome Entry Site (IRES) 的概念和功能。

Internal Ribosome Entry Site (IRES) 是什麼？
IRES 是一種特殊的 RNA 序列，存在於某些 mRNA 分子的 5' 非翻譯區 (5' untranslated region, 5' UTR)。與大多數真核生物 mRNA 不同，後者需要通過 5' 帽結構（m$^7$G）被核糖體小亞基識別並掃描才能啟動轉譯，IRES 允許核糖體直接結合到 mRNA 的內部位點（即 IRES 區域），然後從該位點開始進行轉譯。

IRES 的功能：

1. 獨立轉譯起始： IRES 的主要功能是作為一個獨立的轉譯起始位點。它允許核糖體在沒有 5' 帽結構的情況下，或者在 5' 帽結構被抑制的情況下，也能夠結合到 mRNA 上並啟動蛋白質合成。
2. 多順反子 mRNA 的形成 (在病毒和某些細胞因子中)： 在一些病毒 mRNA 中，IRES 允許一個單一的 mRNA 分子可以編碼多個蛋白質。核糖體可以通過不同的 IRES 區域結合到 mRNA 上，從而獨立地起始合成不同的蛋白質。

此題考查蛋白質表現量增加但 mRNA 量不變的可能原因，以及如何設計實驗驗證。這指向了轉譯後調控或 mRNA 穩定性/轉譯效率的改變。

X 蛋白質增加的可能原因：

1. 轉譯效率提高 (Increased Translation Efficiency)：

   • 原因： 病毒感染可能改變了細胞內的環境，例如通過病毒蛋白或誘導的細胞因子，使得 X 基因的 mRNA 在細胞質中更容易被核糖體識別並進行轉譯，或者減緩了核糖體在 mRNA 上的移動速度，從而增加了蛋白質的合成速率。
   • 可能機制：
     • mRNA 結構改變： 病毒可能誘導了 X 基因 mRNA 的 5' UTR 或 3' UTR 發生某些修飾（如 IRES 的出現或活化，或與 RNA 結合蛋白的相互作用改變），這些修飾有利於核糖體結合或起始轉譯。
     • 細胞內翻譯調控因子改變： 病毒感染可能影響了細胞內參與翻譯起始、延長或終止的因子，使得 X 基因 mRNA 的轉譯被優先進行。

2. 蛋白質降解速率減緩 (Decreased Protein Degradation Rate)：

   • 原因： 病毒感染可能抑制了細胞內負責降解 X 蛋白質的途徑（如泛素-蛋白酶體系統）。如果蛋白質的合成速率不變，但降解速度變慢，那麼蛋白質的總量就會累積增加。
   • 可能機制：
     • 病毒蛋白抑制降解途徑： 病毒可能產生某些蛋白，直接或間接抑制了參與 X 蛋白質降解的酶（如泛素連接酶 E3）。
     • 競爭性抑制： 病毒感染可能導致細胞內其他蛋白質的降解增強，而 X 蛋白質恰好不是被優先降解的對象，相對穩定性增加。

3. 蛋白質的翻譯後修飾 (Post-translational Modifications, PTMs)：

   • 原因： 雖然蛋白質總量增加，但病毒感染可能導致 X 蛋白質發生了某些翻譯後修飾，這些修飾可能使其在檢測（如 Western Blot）時更容易被檢測到（例如，修飾使其更容易被抗體識別），或者這些修飾本身就意味著蛋白質的活性增加，從而表現出「量增加」的表觀現象（儘管總量可能變化不大，但活性形式增加）。

如何設計實驗證明推論？

實驗設計核心： 需要設計實驗來區分是「合成增加」還是「降解減少」，並進一步探究機制。

實驗一：驗證轉譯效率提高

• 方法：
  1. 體外轉譯實驗 (In vitro translation)： 從病毒感染細胞和對照細胞中分離出 mRNA，然後在體外進行轉譯。比較兩種 mRNA 在體外合成 X 蛋白質的量。如果病毒感染細胞的 mRNA 在體外也表現出更高的轉譯效率，則證明是 mRNA 本身或其結合因子的改變導致轉譯效率提高。
  2. 核糖體共沉澱 (Ribosome Immunoprecipitation, RIP) 或 活性翻譯複合物分離 (Active Translationary Complex Isolation, ATCI)： 檢測病毒感染後，X 基因 mRNA 與核糖體結合的程度或其在活性翻譯複合物中的豐度。如果病毒感染後，X mRNA 與核糖體的結合更緊密或更多，則支持轉譯效率提高的論點。

此題為綜合題，涵蓋了基因突變的鑑定、影響、檢測方法及其原理與實驗設計。需要仔細比對序列，運用遺傳密碼表，並結合分子生物學常用的檢測技術。

圖一序列及密碼子對照表分析 (以 Wild-type 為準)：

Wild-type DNA 序列 (部分):
... 2100 CCC AGT GGA GAA GCT CCC AAC CAA GCT CTC ...
... 2110 TTG AGG ATC TTG AAG GAA ACT GAA TTC AAA ...
... 2140 Val 2150 ...
... 2160 Lys Ile Lys ...
... 2170 ...
... 2180 ...
... 2190 ...
... 2200 Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala ...
... 2210 ...
... 2230 Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro ...
...
... AAA GCC AAC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC ...
... Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His ...
... TAC GTG ATG GCC AGC GTG GAC AAC CCC CAC ...
... Thr Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu ...
... GTG TGC CGC CTG CTG GGC ATC TGC CTC ACC ...
... Ser Thr Val Glu Leu Ile Thr Gin Leu Met ...
... TCC ACC GTG CAG CTC ATC ACG CAG CTC ATG ...

Mutation-type DNA 序列 (部分，與 Wild-type 比較):
... 2100 CCC AGT GGA GAA GCT CCC AAC CAA GCT CTC ... (此段 Wild-type 和 Mutation-type 相同)
... 2110 TTG AGG ATC TTG AAG GAA ACT GAA TTC AAA ... (此段 Wild-type 和 Mutation-type 相同)
... 2140 Val 2150 ...
... 2160 Lys Ile Lys ...
... 2170 ...
... 2180 ...
... 2190 ...
... 2200 Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala ...
... 2210 ...
... 2230 Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro ...
...
... AAA GCC AAC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC ...
... Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His ...
... TAC GTG ATG GCC AGC GTG GAC AAC CCC CAC ...
... Thr Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu ...
... GTG TGC CGC CTG CTG GGC ATC TGC CTC ACC ...
... Ser Thr Val Glu Leu Ile Thr Gin Leu Met ...
... TCC ACC GTG CAG CTC ATC ACG CAG CTC ATG ...

圖一提供的突變序列與 Wild-type 的差異，主要體現在：
在 2230 之後的序列：
Wild-type DNA: ... ATC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC ...
Mutation-type DNA: ... ATC AA - ACA TCT CCG ... (這裡原文圖片中的 "-" 符號表示缺失，但實際比對圖示，Mutation-type 的序列是 ATC AA - ACA TCT CCG，這段序列與 Wild-type 的 ATC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC 差異很大。
更仔細地看圖一的序列比對：
圖一顯示的是 2230 氨基酸 Ile 之後的序列。
Wild-type DNA: ... ATC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC ...
Wild-type RNA: ... AUC AAG GAA AUC CUC GAU GAA GCC ...
Wild-type Protein: ... Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro ...

Mutation-type DNA: ... ATC AA - ACA TCT CCG ...
這裡的 "-" 符號表示突變序列中，在 "AA" 之後，Wild-type 的 "G" 缺失了。
所以，Mutation-type DNA 序列在 2230 氨基酸 Ile 之後，從 2231 的 Lys 開始，Wild-type 的序列是 AAG，而 Mutation-type 的序列是 AA-，這表示 Wild-type 的 AAG 變成了 Mutation-type 的 AA-。
這是一個在 AAG 序列中，第二個 A 之後，缺失了一個 G。
也就是說，在 Wild-type 的 AAG 突變成 Mutation-type 的 AA- 時，實際發生的是 AAG -> AA-。這意味著在 AAG 中的 G 缺失了。
這個缺失發生在 2231 號氨基酸 Lys 的編碼序列中。

詳細比對：
Wild-type DNA: ... ATCAAGGAA ATC CTC GAT GAA GCC ...
Wild-type RNA: ... AUCAAGGAA AUC CUC GAU GAA GCC ...
Wild-type Protein: ... Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro ... (Lys 是由 AAG 編碼)

Mutation-type DNA: ... ATC**AA-**ACA TCT CCG ...
這裡的 "-" 代表一個缺失。
這個缺失發生在 Wild-type 的 AAG 序列中的 G 之後。
所以，Wild-type 的 AAG 變成了 Mutation-type 的 AA-。
這是一個單一鹼基缺失 (G)。

這個缺失點在哪裡？
Wild-type DNA 序列：... ATC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC ...
氨基酸：... Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro ...
Lys 的密碼子是 AAG。
GAA 編碼 Glu。
ATC 編碼 Ile。
CTC 編碼 Leu。
GAT 編碼 Asp (這裡題目給的 RNA 序列是 GAU CGU ACA UAU A...，DNA 是 GAT CGT ACA TAT A...，Protein 是 Leu Ala Cys Ile...。但圖一是另外一個基因的片段，不能與前面的題目混淆)。

回到圖一的序列：
Wild-type DNA: ...ATCAAGGAA ATC CTC GAT GAA GCC...
Wild-type RNA: ...AUCAAGGAA AUC CUC GAU GAA GCC...
Wild-type Protein: ...Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro...

Mutation-type DNA: ...ATC**AA-**ACA TCT CCG...
突變點： 在 Wild-type 的 AAG 序列中，缺失了一個 G。
確切位置： 缺失發生在編碼第 2231 位氨基酸 Lys (由 AAG 編碼) 的密碼子中，或者說，缺失發生在 AAG 之後。
更精確地說，缺失的是 AAG 中的 G。
也就是說， Wild-type 的 AAG 變成了 Mutation-type 的 AA-。
這個缺失發生在 AAG 的最後一個鹼基 G 的位置。

(a) 這是屬於那一種型態(種)突變？

• 答案： 這是框移突變 (Frameshift mutation)。具體來說，是一個單一鹼基缺失 (single base deletion)。
  • 精準描述： 在編碼第 2231 位氨基酸 Lys (由 AAG 編碼) 的 DNA 序列中，缺失了一個鹼基 G。這個缺失改變了後續所有密碼子的讀框，導致翻譯後面的所有氨基酸序列都發生改變。

(b) 這種突變是否會造成胺基酸的改變？

• 答案： 會。
  • 說明：
    1. 起始點的胺基酸改變： Wild-type 的 Lys (由 AAG 編碼) 在突變後變成了 AA-。如果我們以 AA- 後面的鹼基 ACA 的 A 作為下一個密碼子的起始，則 AA-ACA 讀起來會是 A-A-C (如果缺失的是 G，則 AAG -> AA-，後續序列是 ACA TCT CCG。則突變後讀框是 AA-AC-ATC-CG... )。
       更正理解： Wild-type 的 AAG 密碼子後面的序列是 GAA (Glu)。
       Mutation-type 序列是 AA-ACA TCT CCG。
       當 Wild-type 的 AAG 缺失 G 後，變成了 AA-。
       接下來的序列是 ACA TCT CCG。
       由於缺失了一個鹼基，原來的讀框被破壞。
       Wild-type 讀框 (從 AAG 開始): AAG (Lys) GAA (Glu) ATC (Ile) CTC (Leu) GAT (Asp) GAA (Glu) GCC (Ala)...
       Mutation-type 讀框 (從 AAG 缺失 G 開始，變為 AA-ACA TCT CCG):

       • 第一個密碼子：AA- (這不是一個完整的密碼子，但如果我們考慮前面的 ATC，它編碼 Ile。那麼突變點在 Lys 的 AAG 之後。所以，我們應該看 Lys 之後的序列。)

       • 從 Lys 之後看：
         Wild-type DNA: ...AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC...
         Wild-type RNA: ...AAG GAA AUC CUC GAU GAA GCC...
         Wild-type Protein: ...Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala...

         Mutation-type DNA: ...AA- ACA TCT CCG...
         這裡的 "-" 代表缺失了 Wild-type 的 AAG 中的 G。
         所以，Wild-type 的 AAG -> AA- (缺失 G)。
         接下來是 Wild-type 的 GAA。
         Mutation-type 的序列是 AA-ACA TCT CCG。
         由於缺失了一個鹼基，後續的讀框就移位了。
         原來的讀框是：AAG / GAA / ATC / CTC / GAT / GAA / GCC...
         突變後，從 AAG 缺失 G 開始，序列變為：AA-ACA TCT CCG...
         新的讀框 (假設從 AA- 開始，但 AA- 本身不是一個完整的密碼子。
         我們應該從上游的 ATC 開始看。
         Wild-type: ...ATC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC...
         Mutation-type: ...ATC AA- ACA TCT CCG...
         這表示在 ATC 之後，Wild-type 是 AAG，而 Mutation-type 是 AA-，然後是 ACA。
         這意味著，在 Wild-type 的 AAG 這個密碼子中，缺失了一個 G。
         因此，Wild-type 的 Lys (AAG) 變成了 Mutation-type 的 AA-。
         這個 AA- 不是一個完整的密碼子。
         如果我們將缺失的 G 視為讀框的起始點，那麼：
         Wild-type: ...ATC AAG GAA ATC CTC GAT GAA GCC...
         Mutation-type: ...ATC AA- ACA TCT CCG...
         從 Lys (AAG) 開始，缺失 G，變為 AA-。
         Wild-type 的 Lys 變成了 Mutation-type 的 AA- (這不是一個標準的胺基酸)。
         然後，原來的 GAA (Glu) 在新的讀框下，變成了 ACA (Thr)。
         原來的 ATC (Ile) 在新的讀框下，變成了 TCT (Ser)。
         原來的 CTC (Leu) 在新的讀框下，變成了 CCG (Pro)。
         因此，從 Lys 之後的胺基酸序列全部改變。
         胺基酸改變為：Lys -> AA- (無意義)，Glu -> Thr，Ile -> Ser，Leu -> Pro，以及後續所有胺基酸的改變。

(C) 如果想要檢測這樣的突變，你會使用什麼方法搭配什麼儀器設備來檢測？

• 答案：
  • 方法： PCR 結合 Sanger 定序 (Sanger Sequencing) 或 PCR 結合變性梯度膠電泳 (DGGE) / 變性高分子聚合物凝膠電泳 (HDPE)。
  • 儀器設備：
    • PCR 儀 (Thermal cycler)
    • 離心機 (Centrifuge)
    • 電泳儀 (Electrophoresis apparatus)
    • DNA 凝膠成像系統 (Gel imaging system)
    • Sanger 定序儀 (DNA Sequencer) (若選 Sanger 定序)
    • UV/Vis 分光光度計 (UV/Vis Spectrophotometer) (用於 DNA 濃度測量)

詳細說明：