112 年 國立臺灣大學醫學檢驗暨生物技術學系碩士班（一般生）《分子生物學（C）》

此題主要在考察學生對分子生物學中重要蛋白質與酵素的功能、參與的生物體以及在 DNA 相關過程中的角色。需要針對每個子題，分別說明其在生物體中的存在、參與的 DNA 過程（如複製、修補、重組等）以及具體作用機制。

(a) DNA polymerase γ (DNA 聚合酶 γ)

• 生物體: 主要存在於人類 (eukaryotes)。
• 參與系統: DNA replication (特別是mitochondrial DNA replication)。
• 功能與機制: DNA 聚合酶 γ 是粒線體 DNA 複製的主要酵素。它負責複製粒線體中的環狀 DNA，對於粒線體功能的維持至關重要。它是一種 processive DNA polymerase，能夠高效地合成 DNA 鏈。

(b) DNA polymerase V (DNA 聚合酶 V)

• 生物體: 主要存在於大腸桿菌 (prokaryotes)。
• 參與系統: DNA repair (特別是 translesion synthesis，也稱為 error-prone repair)。
• 功能與機制: DNA 聚合酶 V 是一種 error-prone polymerase，在 DNA 損傷（如嘧啶二聚體）存在時，能夠繞過損傷位點繼續複製，從而使複製過程得以完成，但可能引入突變。它在 DNA 損傷的修復過程中扮演重要角色。

(c) Mcm2-7 complex (Mcm2-7 複合物)

• 生物體: 主要存在於人類 (eukaryotes)。
• 參與系統: DNA replication (負責 DNA 的起始)。
• 功能與機制: Mcm2-7 複合物是真核生物 DNA 複製的關鍵組分，是 DNA 複製起始複合物 (ORC) 的核心組成部分，其功能類似於一個 helicase。它在複製起始點被募集，並在 DNA 解旋後，作為複製叉的領導鏈和滯後鏈合成的主要 DNA 聚合酶複合物的組成部分。

(d) MSH2/MSH6 (MSH2/MSH6 蛋白質)

• 生物體: 主要存在於人類 (eukaryotes)。
• 參與系統: DNA repair (特別是 mismatch repair, MMR)。
• 功能與機制: MSH2 和 MSH6 蛋白質組成一個異二聚體 (heterodimer)，是人類 DNA 錯配修復系統 (MMR) 的關鍵識別組分。它們能夠識別 DNA 複製過程中產生的鹼基錯配和插入/缺失突變，並啟動後續的修復通路。

(e) Histones H1, H2A, H2B, H3, H4 (組蛋白 H1, H2A, H2B, H3, H4)

• 生物體: 主要存在於人類 (eukaryotes)。
• 參與系統: DNA structure (組成核小體，調節染色質結構)。
• 功能與機制: 組蛋白是真核生物 DNA 包裝的基本單位。

此題考查學生對細胞內各種 RNA 種類的認識。細胞內存在多種類型的 RNA，它們在基因表達和細胞功能中扮演著不同的角色。

細胞內主要存在的 RNA 種類及其功能如下：

1. 信使 RNA (Messenger RNA, mRNA):

   • 功能: 作為 DNA 序列的轉錄產物，攜帶遺傳密碼，指導蛋白質的合成。mRNA 在細胞質中與核糖體結合，作為轉譯的模板。
   • 結構特點: 在真核生物中，mRNA 經過剪接、加帽 (5' cap) 和加尾 (poly-A tail) 等轉譯後修飾。

2. 核糖體 RNA (Ribosomal RNA, rRNA):

   • 功能: 是核糖體 (ribosome) 的結構和催化活性組分。rRNA 參與蛋白質的合成，不僅提供蛋白質合成的結構框架，還具有催化胜肽鍵形成的核酶 (ribozyme) 活性。
   • 種類: 存在於大亞基 (large subunit) 和小亞基 (small subunit) 中，例如 28S rRNA, 18S rRNA, 5.8S rRNA, 5S rRNA (真核生物)。

3. 轉運 RNA (Transfer RNA, tRNA):

   • 功能: 在蛋白質合成過程中，負責識別 mRNA 上的密碼子 (codon)，並將對應的胺基酸攜帶到核糖體上，參與胜肽鏈的延伸。
   • 結構特點: 具有獨特的 L 形或三葉草結構，一端有反密碼子 (anticodon) 結合 mRNA，另一端連接特定的胺基酸。

4. 小核仁 RNA (Small nucleolar RNA, snoRNA):

此題考查學生對原核生物操縱子 (operon) 概念的理解及其工作原理。

操縱子 (Operon) 的定義：
操縱子 (operon) 是原核生物基因調控的一個重要概念，它指的是一組緊密排列、功能相關的基因，以及它們共享的調控元件（啟動子、操縱序列、終止子等），這些基因通常一起被轉錄成一個多順反子 mRNA (polycistronic mRNA)，並協同調控。操縱子結構包含：

1. 啟動子 (Promoter): RNA 聚合酶結合並開始轉錄的位點。
2. 操縱序列 (Operator): 是一個 DNA 序列，通常位於啟動子附近或內部，是阻遏蛋白 (repressor protein) 結合的位點。
3. 結構基因 (Structural genes): 編碼特定功能蛋白質（通常是參與同一代謝途徑的酶）的一組基因。
4. 調節基因 (Regulatory gene): 編碼一個調節蛋白（如阻遏蛋白或激活蛋白）的基因，該基因的位置可以獨立於操縱子。

操縱子工作原理的例子：大腸桿菌的乳糖操縱子 (lac operon)
乳糖操縱子 (lac operon) 是原核生物基因調控的經典例子，它調控大腸桿菌利用乳糖作為碳源的能力。lac operon 包含三個結構基因：lacZ (編碼 β-半乳糖苷酶，將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖)、lacY (編碼乳糖滲透酶，將乳糖運輸入細胞) 和 lacA (編碼硫代半乳糖苷酶，功能尚不明確)。

• 調控元件: lac operon 包含一個啟動子 (P)、一個操縱序列 (O) 和一個調節基因 lacI (編碼 lac 阻遏蛋白)。
• 工作機制:
  1. 無乳糖存在時 (Glucose 存在):

此題考查學生對於如何在真核細胞中降低特定基因表現的實驗方法。基因表現的降低 (depletion) 通常意味著減少目標基因的 mRNA 或蛋白質水平。

以下是幾種常用的實驗方法及其操作步驟：

方法一：RNA 干擾 (RNA Interference, RNAi) - 透過 siRNA 或 shRNA

• 核心原理: 利用外源性的雙鏈 RNA (siRNA) 或內源性生成的短髮夾 RNA (shRNA) 來誘導細胞內的 RNA 干擾途徑，最終導致目標 mRNA 被降解，從而降低目標基因的表現。

• 實驗步驟:

  1. 設計與合成 siRNA 或 shRNA: 根據目標基因的 mRNA 序列，設計並合成特異性的 siRNA 分子，或設計一段表達 shRNA 的質體 (plasmid)。shRNA 質體在細胞內表達後，會進一步被加工成 siRNA。
  2. 將 siRNA/shRNA 導入細胞:
     • siRNA: 可以通過轉染 (transfection) 方法（如脂質體轉染、電穿孔）將合成的 siRNA 直接導入真核細胞。
     • shRNA: 將攜帶 shRNA 基因的質體通過轉染方法導入細胞。若需要長期穩定地降低基因表現，可以將 shRNA 質體整合到細胞基因組中（如使用慢病毒載體，lentivirus）。
  3. 驗證基因表現降低: 在導入 siRNA/shRNA 後一段時間（通常 24-72 小時），通過以下方法驗證目標基因的 mRNA 和蛋白質水平是否顯著降低：
     • 定量 PCR (qPCR): 檢測目標基因 mRNA 的相對含量。
     • 西方墨點法 (Western Blot): 檢測目標基因所編碼蛋白質的表達水平。
     • 免疫螢光染色 (Immunofluorescence): 觀察蛋白質在細胞內的定位和表達水平。

方法二：基因敲低 (Gene Knockdown) - 透過反義寡核苷酸 (Antisense Oligonucleotides, ASOs)

此題考查學生對基因表達調控重要性及其失調後果的理解。

為何基因表達調控很重要？

基因表達調控是維持生命活動正常進行的基礎，其重要性體現在以下幾個方面：

1. 細胞分化與組織形成: 在多細胞生物體中，所有細胞（除了生殖細胞）都擁有相同的基因組。然而，不同的細胞類型（如神經細胞、肌肉細胞、肝細胞）具有截然不同的結構和功能。這種差異性正是通過選擇性地開啟或關閉特定的基因來實現的，即基因表達的精確調控。這使得細胞能夠分化形成各種組織和器官，構建複雜的生物體。
2. 適應環境變化: 生物體需要根據內在生理狀態和外在環境的變化來調整其生理活動。基因表達的調控允許細胞在不同條件下（如營養供應、溫度變化、壓力刺激）快速響應，合成所需的蛋白質或關閉不必要的通路，以維持穩態 (homeostasis) 和生存。
3. 能量和資源節約: 基因表達的調控確保了蛋白質的合成只在需要時發生，且合成量恰到好處。這避免了不必要的蛋白質合成，節省了細胞寶貴的能量和氨基酸等資源。例如，當某種代謝物的濃度很高時，合成該代謝物的酶的基因表達就會被抑制。
4. 發育過程的精確控制: 從受精卵發育成一個完整的個體，需要一系列複雜而有序的基因表達事件。基因表達的時空特異性調控是胚胎發育成功的關鍵，任何一個環節的失序都可能導致發育異常。
5. 維持細胞穩態與防止疾病: 穩定的基因表達模式是細胞正常功能的基礎。一旦基因表達失調，可能導致細胞功能異常，甚至引發疾病，如癌症、代謝性疾病、免疫缺陷病等。

基因表達失調的後果範例：

如果基因表達失調，可能導致各種嚴重的後果。以下以癌症 (Cancer) 為例：

此題考查學生如何設計實驗來探究一個特定的轉錄因子 (Y protein) 是否調控另一個基因 (X gene) 的表達。這需要結合體外和體內 (in vitro and in vivo) 的實驗方法來證明轉錄因子與目標基因啟動子之間的結合，以及這種結合對基因表達的影響。

以下是可行的實驗設計步驟：

第一階段：證明 Y 蛋白能與 X 基因的啟動子區域結合 (In vitro/In vivo Binding Assays)

1. 體外實驗 (In vitro):

   • EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay / Gel Shift Assay):

     • 原理: 將純化的 Y 蛋白（或含有 Y 蛋白的細胞裂解液）與一段標記過的 X 基因啟動子區域的 DNA 片段（通常是放射性同位素或螢光標記）混合。如果 Y 蛋白能結合該 DNA 片段，則形成的蛋白質-DNA 複合物會比單獨的 DNA 片段在電泳膠上移動得更慢，從而觀察到「移動位移」(shift)。
     • 步驟:
       a. 合成或 PCR 擴增 X 基因啟動子區域的 DNA 片段。
       b. 對 DNA 片段進行標記。
       c. 獲取純化的 Y 蛋白或含有 Y 蛋白的細胞提取物。
       d. 將標記的 DNA 與蛋白質在適當緩衝液中孵育。
       e. 進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳 (native PAGE)，然後進行放射自顯影或螢光檢測。
     • 驗證: 觀察到移動位移，並通過加入過量的非標記的啟動子 DNA（競爭實驗）或帶有 Y 蛋白結合位點突變的 DNA 來確認結合的特異性。

   • DNase I Footprinting Assay:

     • 原理: 如果 Y 蛋白結合在 X 基因啟動子區域的特定 DNA 位點上，那麼 DNase I 在該區域的酶切位點就會被 Y 蛋白保護起來，從而形成一個「腳印」(footprint)，表明 Y 蛋白的結合位點。
     • 步驟:
       a. 準備一個單鏈標記的 X 基因啟動子 DNA 片段。
       b. 將 DNA 與 Y 蛋白孵育。
       c. 加入少量 DNase I，使其對 DNA 進行隨機切斷。
       d. 通過變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分析切斷產物，並與沒有 Y 蛋白但進行相同 DNase I 處理的 DNA 進行比較。
     • 驗證: 觀察到 Y 蛋白結合區域的切斷位點減少或消失。

2. 體內實驗 (In vivo):

   • ChIP (Chromatin Immunoprecipitation):
     • 原理: 這種方法用於證明 Y 蛋白在活細胞內是否與 X 基因的啟動子區域結合。首先，將活細胞用甲醛交聯，使蛋白質與 DNA 緊密結合。然後，裂解細胞，用特定抗體（針對 Y 蛋白）免疫沉澱含有 Y 蛋白的蛋白質-DNA 複合物。最後，通過 PCR 或 qPCR 來檢測沉澱的 DNA 中是否富集了 X 基因的啟動子區域序列。
     • 步驟:
       a. 在表達 Y 蛋白和 X 基因的細胞中進行甲醛交聯。

此題考查學生對轉譯過程中胜肽鍵形成機制的核心組分的理解。

核心觀念: 胜肽鍵是在核糖體上，將胺基酸連接起來形成蛋白質鏈的過程。這個過程主要由核糖體本身，特別是其大亞基，以及參與的 tRNA 所完成。

解題分析:

• (A) Aminoacyl tRNA: Aminoacyl tRNA 是攜帶胺基酸的 tRNA。它將胺基酸帶到核糖體上，並通過其反密碼子與 mRNA 上的密碼子配對。它本身不直接催化胜肽鍵的形成，但提供了胺基酸。
• (B) Ribosome large subunit: 核糖體的大亞基包含催化胜肽鍵形成的活性中心，稱為肽酰轉移酶中心 (peptidyl transferase center)。這個中心由 rRNA（核酶）和蛋白質組成，能夠催化一個胺基酸的胺基與另一個胺基酸的羧基之間形成胜肽鍵。

此題考查學生對 RNA splicing 的理解，特別是其發生機制、發生細胞類型、調控組分及與轉譯的關係。需要找出所有錯誤的敘述。

核心觀念: RNA splicing 是真核生物中前體 mRNA (pre-mRNA) 加工過程的重要一步，用於移除內含子 (intron) 並連接外顯子 (exon)。這個過程由剪接體 (spliceosome) 完成，剪接體由小核 RNA (snRNA) 和蛋白質組成。

各選項分析:

(A) Splicing 可發生於不同 RNA 間

• 分析: 這種現象稱為反式剪接 (trans-splicing)。雖然大多數情況下 splicing 發生在同一條 pre-mRNA 分子內部（順式剪接, cis-splicing），但反式剪接確實存在，例如在某些寄生蟲（如錐蟲）和真核生物中，可以將來自不同 RNA 分子的外顯子連接起來。因此，此敘述是正確的。

(B) Splicing 不會發生於原核細胞中

• 分析: 原核生物的基因通常是連續編碼的，即沒有內含子。因此，它們的前體 mRNA 不需要進行 splicing 來移除內含子。雖然極少數情況下原核生物也發現了內含子（稱為 inteins，它們可以自我催化移除），但普遍意義上，RNA splicing 是真核生物特有的加工過程。此敘述是正確的。

(C) Spliceosome 引導 splicing 過程中 RNA 的截切與黏合

• 分析: 剪接體 (spliceosome) 是由多個小核核糖核蛋白 (snRNPs) 和其他蛋白質組成的複雜分子機器，它負責識別內含子的兩

此題考查學生對病毒快速演化現象與不同類型基因突變之間關係的理解。病毒（特別是 RNA 病毒）之所以能快速演化，是因為其複製過程中容易發生突變，且其基因組相對較小，突變累積的影響更容易顯現。

核心觀念:

• RNA 病毒的複製: RNA 病毒的 RNA 聚合酶通常缺乏校對 (proofreading) 功能，導致複製錯誤率較高，產生較多突變。
• 突變類型:
  • Nonsense mutation (無義突變): 將一個密碼子轉變為終止密碼子 (stop codon)，導致蛋白質合成提前終止。
  • Silent mutation (同義突變): 密碼子的改變不改變所編碼的胺基酸。
  • Frameshift mutation (移碼突變): 插入或刪除的核苷酸數量不是三個的倍數，導致讀碼框 (reading frame) 移位，從突變點之後所有密碼子的意義都改變，通常會產生一個截短且無功能的蛋白質。
  • Missense mutation (錯義突變): 將一個密碼子改變為編碼另一個胺基酸的密碼子。
  • Small deletion/insertion: 插入或刪除少量核苷酸。如果剛好是三個的倍數，則可能只影響一個或幾個胺基酸；如果不是，則會導致移碼突變。

此題考查學生對 Suppressor tRNA 的概念及其作用機制的理解。

核心觀念:
Suppresor tRNA 是一種突變的 tRNA 分子，它能夠識別一個非正常終止密碼子 (stop codon)，並在其位置上加入一個胺基酸，從而「抑制」了該終止密碼子的作用，允許蛋白質合成得以繼續。

詳細解釋:

1. 正常轉譯終止: 在轉譯過程中，當核糖體遇到 mRNA 上的終止密碼子 (UAA, UAG, UGA) 時，沒有對應的 tRNA 能夠識別這些密碼子。此時，終止因子 (release factors) 會結合到核糖體上，導致胜肽鏈從 tRNA 上釋放，轉譯終止。
2. 突變的 tRNA: Suppressor tRNA 是一種突變的 tRNA。這種突變通常發生在 tRNA 的反密碼子 (anticodon) 區域。例如，一個原本識別穀氨酸 (glutamine) 的 tRNA，其反密碼子可能發生突變，使其能夠識別一個終止密碼子，如 UAG (琥珀色終止密碼子)。

此題考查學生對真核生物起始因子 eIF2 在調控整體轉譯效能中的作用的理解。

核心觀念:
真核生物的轉譯起始是一個複雜的多步驟過程，其中起始因子 (eukaryotic initiation factors, eIFs) 起著關鍵作用。eIF2 是其中一個非常重要的調節因子，它在控制是否啟動蛋白質合成方面扮演著「剎車」的角色。

eIF2 的結構與功能:

• eIF2 是一個異三聚體 (heterotrimer)，由三個亞基組成：α (alpha), β (beta), 和 γ (gamma)。
• eIF2-GTP 複合物負責結合起始 tRNA (Met-tRNAi^Met) 形成 ternary complex。
• 這個 ternary complex 接著與 40S 核糖體亞基結合，形成 40S-Met-tRNAi^Met 複合物。
• 然後，這個複合物會尋找 mRNA 的 5' 端帽子結構，並沿著 mRNA 移動，直到找到起始密碼子 (AUG)。
• 一旦找到起始密碼子，40S 亞基會與 60S 核糖體亞基組裝成完整的 80S 核糖體，轉譯就可以開始。

eIF2 的調節機制:
eIF2 的活性受到嚴格的調控，主要是通過其 α 亞基的磷酸化 (phosphorylation)。當 eIF2 的 α 亞基被磷酸化後，它會與一個叫做 eIF2B (一個鳥苷酸交換因子, guanine nucleotide exchange factor, GEF) 的蛋白質結合。

• eIF2B 的作用: eIF2B 的主要功能是將與 eIF2-GDP 結合的 GDP 替換為 GTP，從而使 eIF2 恢復到其活躍的 eIF2-GTP 形式，能夠再次結合起始 tRNA 並啟動轉譯。
• 磷酸化 eIF2α 的影響:
  • 當 eIF2 的 α 亞基被磷酸化時，磷酸化的 eIF2α 會與 eIF2B 發生強烈結合。
  • 這種強烈結合會**「捕獲」eIF2B**，使其無法再與 eIF2-GDP 結合並進行 GDP/GTP 交換。

此題考查學生對真核生物 RNA polymerase II 的 C-terminal domain (CTD) 在轉錄調控中的作用的理解。

核心觀念:
RNA polymerase II (RNAP II) 的 CTD 是其 C 端的一個可變區域，由高度重複的 YSPTSPS (酪氨酸-絲氨酸-脯氨酸-蘇氨酸-絲氨酸-脯氨酸-絲氨酸) 肽序列組成。這個 CTD 的磷酸化狀態在轉錄的起始、延伸和終止等不同階段會發生動態變化，並與轉錄相關的蛋白質複合體相互作用，從而調節轉錄活性。

CTD 的結構與磷酸化:

• CTD 由大約 26-52 次重複的 YSPTSPS 序列組成。
• 這些重複序列中的絲氨酸 (Serine, S)、蘇氨酸 (Threonine, T) 和酪氨酸 (Tyrosine, Y) 可以被磷酸化。
• 在轉錄的不同階段，CTD 的磷酸化模式會發生系統性的變化，這被稱為 CTD 的「磷酸化週期」(phosphorylation cycle)。

CTD 在轉錄調節中的功能:

1. 轉錄起始 (Transcription Initiation):

   • 在轉錄起始階段，RNAP II 尚未被磷酸化，其 CTD 處於未磷酸化 (hypophosphorylated) 或低磷酸化 (lowly phosphorylated) 狀態。
   • 此時，未磷酸化的 CTD 能夠與轉錄起始複合物 (Transcription Initiation Complex, TIC) 的組分（如 TBP, TFIIB）以及 CBP/p300 等組蛋白乙醯化酶 (histone acetyltransferases, HATs) 結合。
   • HATs 的活性有助於鬆弛染色質結構，為 RNAP II 的結合和啟動提供便利。
   • 起始複合物形成後，TFIIH（一個包含激酶活性的因子）中的激酶亞基 (Kin28/cdk7) 開始磷酸化 CTD 的絲氨酸 2 (Ser2) 和絲氨酸 5 (Ser5)。

2. 轉錄延伸 (Transcription Elongation):

   • 隨著 RNAP II 開始沿著 DNA 移動，CTD 的磷酸化模式發生變化。

核心觀念

此轉殖 DNA 由單一個 Promoter 驅動轉錄，產生一條雙順反子（bicistronic）mRNA：

• NLS（nuclear localization signal）：將與其融合的蛋白質送入細胞核。
• mCherry：紅色螢光蛋白。
• IRES（internal ribosome entry site）：可讓核糖體在 mRNA 中間部位重新起始翻譯，使下游 GFP 也能被翻譯。
• polyA signal：促進 mRNA 的成熟與穩定。

解題方法

先依序判斷轉錄與翻譯：

1. Promoter 產生一條完整 mRNA。
2. 核糖體由 mRNA 5′端開始翻譯，形成 NLS-mCherry 融合蛋白。
3. 核糖體經由 IRES 在下游重新起始，翻譯出 GFP。
4. NLS 只會定位與其相連的 mCherry，不會使 IRES 下游的 GFP 一起進入細胞核。

因此，此構築體可表現兩種蛋白質。

(1) 蛋白質種類

共有 兩種蛋白質：

1. NLS-mCherry 融合蛋白
2. GFP

NLS 是定位訊號，不會被視為額外的一種蛋白質。

(2) 螢光顯微鏡下的樣態

• mCherry 具有 NLS，因此紅色螢光主要集中在細胞核內。
• GFP 由 IRES 啟動下游翻譯，未連接 NLS，因此主要分布於細胞質。

所以可觀察到：

此題要求學生針對一個關於癌症轉移的假說，設計一系列實驗來驗證。假說內容包含 A 基因突變、蛋白質磷酸化、與 B 蛋白交互作用、C 轉錄因子核定位、以及下游基因表達與癌症預後的關聯。實驗設計需要涵蓋以下幾個關鍵點：

假說核心:
突變的 RTK-A → 磷酸化增強 → 與 B 蛋白作用 → C 轉錄因子入核 → 下游基因表達 → 促進轉移 → 預後差。

實驗設計步驟:

第一部分：驗證突變的 A 蛋白磷酸化增強

1. 實驗對象: 正常細胞系 vs. 攜帶突變 A 基因的細胞系 (或引入突變 A 基因的細胞系)。
2. 實驗方法:
   • 西方墨點法 (Western Blot) - 磷酸化特異性抗體:
     • 目的: 證明突變 A 蛋白比野生型 A 蛋白有更高的磷酸化水平。
     • 步驟:
       a. 獲得表達野生型 A 蛋白和突變型 A 蛋白的細胞裂解液。
       b. 使用針對 A 蛋白的總抗體 (total A antibody) 進行 Western Blot，確認 A 蛋白表達。
       c. 使用針對 A 蛋白特定磷酸化位點的抗體 (phospho-specific A antibody) 進行 Western Blot。
     • 問題: 突變的 A 蛋白是否比野生型 A 蛋白表現出更高水平的磷酸化？
     • 結果判讀: 如果突變型 A 蛋白在磷酸化抗體檢測下訊號更強，則證明磷酸化增強。
   • 質譜分析 (Mass Spectrometry):
     • 目的: 精確鑑定 A 蛋白被磷酸化的位點，並比較野生型和突變型。
     • 步驟: 免疫沉澱 A 蛋白，然後進行質譜分析，鑑定磷酸化胜肽。

第二部分：驗證突變 A 蛋白與 B 蛋白的交互作用

1. 實驗對象: 同上。
2. 實驗方法:
   • 免疫沉澱-西方墨點法 (Co-Immunoprecipitation, Co-IP):
     • 目的: 證明 A 蛋白（特別是磷酸化的 A 蛋白）與 B 蛋白在細胞內發生交互作用。
     • 步驟:
       a. 用抗 A 蛋白的抗體沉澱細胞裂解液中的 A 蛋白。
       b. 洗滌後，用 Western Blot 檢測沉澱物中是否含有 B 蛋白（使用抗 B 蛋白的抗體）。
       c. 可以考慮在實驗前或實驗中加入磷酸酶抑制劑，以維持 A 蛋白的磷酸化狀態。
       d. 也可嘗試使用磷酸化的 A 蛋白特異性抗體進行沉澱，再檢測 B 蛋白，以證明磷酸化的 A 蛋白與 B 蛋白作用。
     • 問題: 磷酸化的突變型 A 蛋白是否比野生型 A 蛋白與 B 蛋白的結合更強？
     • 結果判讀: 如果沉澱物中 B 蛋白的量在突變型 A 蛋白表達的細胞中顯著增加，則證明交互作用增強。
   • 酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid):
     • 目的: 體外驗證 A 蛋白和 B 蛋白之間是否存在直接的蛋白質-蛋白質交互作用。
     • 步驟: 將 A 蛋白的 DNA 序列與 DNA 結合域 (BD) 融合，將 B 蛋白的 DNA 序列與激活域 (AD) 融合，轉染到酵母細胞中。如果兩者相互作用，則會激活報告基因（如 HIS3, LacZ）的表達。
     • 問題: A 蛋白與 B 蛋白之間是否存在直接的交互作用？突變是否影響這種交互作用？

第三部分：驗證 A-B 複合物促進 C 轉錄因子進入細胞核

1. 實驗對象: 同上，並需要檢測 C 轉錄因子在細胞核和細胞質的分佈。
2. 實驗方法:
   • 細胞核-細胞質分離與 Western Blot:
     • 目的: 比較不同細胞系（表達野生型 A、突變型 A、或不表達 A 蛋白）中，C 轉錄因子在細胞核和細胞質中的豐度。
     • 步驟:
       a. 從上述細胞系中分離細胞核和細胞質組分。
       b. 分別對核組分和質組分進行 Western Blot，使用抗 C 轉錄因子的抗體。
       c. 同時使用核蛋白標誌物（如 Lamin B1）和細胞質蛋白標誌物（如 GAPDH）來驗證分離的純度。
     • 問題: 在表達突變型 A 蛋白的細胞中，C 轉錄因子是否更多地定域在細胞核？
     • 結果判讀: 如果突變型 A 蛋白的細胞中，C 蛋白在核組分中的豐度顯著高於野生型或對照組，則證明 A 蛋白（可能通過與 B 蛋白形成複合物）促進了 C 的核定位。
   • 免疫螢光染色 (Immunofluorescence):
     • 目的: 直觀觀察 C 轉錄因子在細胞內的定位。
     • 步驟:
       a. 將細胞固定，用抗 C 轉錄因子的抗體染色。
       b. 在螢光顯微鏡下觀察 C 蛋白的螢光信號在細胞核和細胞質中的分佈。
       c. 可以同時對 A 蛋白進行染色，觀察其與 C 蛋白定位的關係。
     • 問題: C 蛋白在表達突變型 A 蛋白的細胞中是否更傾向於定域在細胞核？

此題考查學生對液態活檢 (Liquid Biopsy) 的基本概念、樣本來源、檢測標的及其臨床應用的理解。

A. 甚麼是液態活檢?例如那些種類的檢體屬於液態活檢?

• 定義: 液態活檢是指通過分析人體體液（如血液、尿液、唾液、腦脊髓液、胸腹腔積液等）中的生物標誌物，來獲取與疾病相關的資訊，特別是腫瘤資訊的一種診斷技術。它是一種非侵入性或微創性的檢測方法，與傳統組織活檢相比，具有創傷小、風險低、可重複性高等優點。
• 檢體種類:
  • 血液 (Blood): 是最常用、最廣泛的液態活檢樣本。
  • 尿液 (Urine): 常用於檢測泌尿系統腫瘤（如膀胱癌、腎癌）。
  • 唾液 (Saliva): 常用於檢測口腔癌、鼻咽癌等。
  • 腦脊髓液 (Cerebrospinal Fluid, CSF): 用於檢測中樞神經系統的腫瘤。
  • 胸腹腔積液 (Pleural fluid, Ascites fluid): 用於檢測胸腔或腹腔的腫瘤。
  • 精液 (Semen)。
  • 乳汁 (Breast milk)。
  • 汗液 (Sweat)。

B. 液態活檢中有那些分子可以做為檢驗的標的?

液態活檢主要檢測體液中釋放出來的腫瘤細胞衍生的生物分子，這些分子可以作為疾病的標誌物：

1. 循環腫瘤細胞 (Circulating Tumor Cells, CTCs): 從原發腫瘤脫落並進入血液循環的完整腫瘤細胞。
2. 循環腫瘤 DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA): 腫瘤細胞凋亡或壞死後釋放到血液中的 DNA 片段。ctDNA 通常帶有來自腫瘤的基因突變、拷貝數變異 (CNV)、表觀遺傳學改變等特徵。
3. 外泌體 (Exosomes): 由細胞（包括腫瘤細胞）釋放的小囊泡，內含蛋白質、RNA (mRNA, miRNA) 和 DNA。
4. 循環腫瘤 RNA (Circulating Tumor RNA, ctRNA): 如 mRNA, miRNA, lncRNA 等，存在於血液或細胞外。

此題考查學生對次世代定序 (NGS) 技術的了解，包括其原理和應用。

核心觀念:
次世代定序 (NGS)，也稱為高通量定序 (High-throughput sequencing)，是指新一代的 DNA 定序技術，相較於傳統 Sanger 定序，NGS 能夠在短時間內對數百萬甚至數十億個 DNA 片段進行平行定序，從而大大提高了定序的通量、速度和降低了成本。

熟悉的 NGS 平台及其原理 (以 Illumina Sequencing by Synthesis 為例)

Illumina 平台是目前最廣泛使用的 NGS 技術之一，其原理如下：

1. DNA 片段化與接頭連接 (Library Preparation):

   • 待定序的 DNA 被打斷成小片段。
   • 在片段的兩端連接上特定的接頭 (adapters)。這些接頭包含定序所需的引物結合位點、索引序列 (index sequences) 和用於叢集形成 (cluster generation) 的序列。

2. 叢集形成 (Cluster Generation / Bridge Amplification):

   • 將連接好接頭的 DNA 片段固定在一個固態載體（如流動槽 Flow Cell）的表面。
   • 流動槽表面塗覆了寡核苷酸探針，這些探針與 DNA 片段的接頭序列互補。
   • 在 PCR 條件下，DNA 片段的接頭與流動槽表面的探針結合，然後進行橋式 PCR (bridge PCR)。
   • 橋式 PCR 使得每個 DNA 片段在流動槽表面形成一個密集的「叢集」(cluster)，每個叢集都包含成千上萬個相同 DNA 片段的複製品。

3. 定序 (Sequencing by Synthesis):

   • 這是 Illumina 平台的核心步驟。
   • 在流動槽中加入定序緩衝液、DNA 聚合酶和四種帶有螢光標記和終止基團的核苷酸 (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)。
   • DNA 聚合酶將螢光標記的核苷酸一個一個地添加到叢集中每個 DNA 分子的 3' 端，並在加入後終止聚合，確保一次只加入一個核苷酸。
   • 每次加入一個核苷酸後，流動槽會被激發，並用 CCD 相機記錄下每個叢集發出的螢光信號。不同的核苷酸連接的螢光基團顏色不同（如 A-綠, T-紅, C-黃, G-藍）。
   • 記錄下螢光信號後，螢光基團和終止基團會被化學方法切除，然後進行下一次核苷酸的加入。
   • 重複這個過程，直到叢集中的 DNA 片段被完全定序。每個叢集的螢光信號變化序列就代表了該 DNA 片段的鹼基序列。

4. 數據分析 (Data Analysis):

   • 通過圖像識別軟體，將每個叢集的螢光信號轉化為鹼基序列 (base calling)。

此題考查學生對 RT-qPCR 和 Western Blot 結果差異的分析能力，以及對 post-transcriptional 或 post-translational 調控機制的理解。

核心觀念:

• RT-qPCR: 主要用於檢測mRNA 水平。它反映的是基因的轉錄活性。
• Western Blot: 主要用於檢測蛋白質水平。它反映的是基因的轉譯和蛋白質穩定性。
• 結果差異的分析: 當 mRNA 水平與蛋白質水平不一致時，意味著在轉錄後或轉譯後存在調控機制。

結果分析與原因探討:

觀察到的現象:

• RT-qPCR: 藥物處理前後 X 基因的 mRNA 水平無顯著差異。
• Western Blot: 藥物處理後 X 基因的蛋白質水平明顯增加。

原因分析:
這表示藥物處理並沒有顯著影響 X 基因的轉錄（mRNA 水平未變），但是卻顯著增加了 X 基因所編碼蛋白質的豐度。這表明存在一種轉譯後 (post-translational) 或轉錄後 (post-transcriptional) 的調控機制，導致蛋白質水平的增加。

最可能的原因包括：

1. 蛋白質降解減緩 (Decreased Protein Degradation):

   • 機制: 藥物可能抑制了細胞內負責降解 X 蛋白質的酶（如蛋白酶體 proteasome 或溶酶體 lysosome）的活性，或者抑制了 X 蛋白質的泛素化 (ubiquitination) 過程。
   • 結果: 即使 mRNA 水平不變，蛋白質的半衰期 (half-life) 延長，導致細胞內蛋白質總量積累增加。這是最常見且最符合結果的解釋。

2. 轉譯效率增強 (Increased Translation Efficiency):

   • 機制: 藥物可能促進了 X 基因 mRNA 的轉譯過程。例如，藥物可能影響了起始因子、延伸因子，或 mRNA 的穩定性/可及性 (accessibility)，從而提高了 mRNA 翻譯成蛋白質的速率。
   • 結果: 雖然 mRNA 總量不變，但其被翻譯成蛋白質的速率加快，導致蛋白質總量增加。

3. 蛋白質活性增加 (Increased Protein Activity - 較少直接影響豐度):

   • 有時藥物可能通過磷酸化等方式激活蛋白質，使其活性增加，但這通常不直接導致蛋白質「總量」的顯著增加，除非激活後蛋白質變得更穩定。

4. mRNA 穩定性增加 (Increased mRNA Stability - 影響較間接):

   • 如果藥物增加了 X 基因 mRNA 的穩定性，那麼在穩態下，mRNA 的合成速率可能與降解速率持平，但若降解減緩，mRNA 累積，可能間接影響蛋白質合成，但這通常也需要轉譯效率的配合。

最可能的解釋是蛋白質降解減緩。

接下來的實驗設計:

為了驗證上述原因，我們可以設計以下實驗：

1. 驗證蛋白質降解減緩 (最優先):
   • 實驗方法: 蛋白質穩定性實驗 (Protein Stability Assay)。
   • 步驟: