108 年 國立臺灣大學醫學檢驗暨生物技術學系碩士班（一般生）《分子生物學（C）》

此題考驗對轉譯 (translation) 過程中，胺基酸與密碼子 (codon) 配對機制的理解。

核心觀念：轉譯過程需要將正確的胺基酸連接到對應的 tRNA 上，並且 tRNA 上的反密碼子 (anticodon) 必須能與 mRNA 上的密碼子正確配對，才能確保蛋白質合成的準確性。

詳解：
(A) Ribosome, large subunit：核糖體大次單元主要負責催化胜肽鍵的形成，而非胺基酸與密碼子的配對。
(B) aminoacyl tRNA synthetase：這是此題的關鍵。aminoacyl tRNA synthetase（胺醯tRNA合成酶）負責將正確的胺基酸活化，並共價連接到其對應的 tRNA 分子上，形成 aminoacyl-tRNA。這個過程稱為 tRNA 的「胺醯化」(aminoacylation)。每個 aminoacyl tRNA synthetase 具有辨識特定胺基酸和對應 tRNA 的能力，確保了「胺基酸」與「tRNA」之間的正確配對。而 tRNA 上的反密碼子則負責與 mRNA 上的密碼子進行配對。

此題考驗對轉譯 (translation) 過程中，胜肽鍵形成機制的理解。

核心觀念：轉譯是將 mRNA 上的遺傳密碼轉譯成蛋白質序列的過程，其中核糖體 (ribosome) 是主要的分子機器，而其大次單元 (large subunit) 含有催化胜肽鍵形成的活性位。

詳解：
(A) Ribosome, large subunit：核糖體大次單元中的核酸 (rRNA) 具有催化活性 (ribozyme)，能夠催化相鄰的胺醯-tRNA (aminoacyl-tRNA) 上的胺基酸與 P 位點 (P-site) 上胜肽鏈末端的胺基酸之間形成胜肽鍵 (peptide bond)。

核心觀念

本題考的是突變類型與基因產物功能變化的關係。判讀時須區分兩種功能喪失的程度：

• 功能減弱型（hypomorphic）：基因產物仍保留部分正常活性，但活性或有效產物量降低。
• 完全失能型（null／amorphic）：正常功能完全喪失，例如無法產生功能性蛋白質。

**錯義突變（missense mutation）**是指編碼序列的變化使某個密碼子改為編碼不同的胺基酸。蛋白質通常仍能合成，但胺基酸替換若影響活性部位、摺疊或分子間結合，就能使功能降低。

題幹未交代「功能降低」是否仍保留部分活性，也未提供變異位置；以下依其指向「仍保留部分活性的功能減弱型變異」作答，選 （C）錯義突變。

解題方法

切入點是辨認哪一種突變最直接對應「蛋白質仍存在，但功能減弱」。

例如，酵素活性部位附近的一個胺基酸被替換後，蛋白質整體結構仍能維持，卻因受質結合能力下降而使催化活性降低。這是錯義突變造成部分功能喪失的典型情境。

相較之下，移碼突變常使後續胺基酸序列大幅改變，並引入提早終止密碼子，因此更常與嚴重功能缺損相連。不能僅憑題幹的「功能降低」，就把它解讀成「功能大幅降低」並選移碼突變。

選項分析

（A）transversion mutation：顛換突變

指嘌呤與嘧啶之間的鹼基替換，例如 A 變成 C、G 變成 T。這是依鹼基替換方式命名，並未直接描述蛋白質功能的變化。

顛換發生在編碼區時，可造成同義、錯義或無義突變；發生在其他區域時，影響又不同。因此，單憑「顛換」不能直接判定功能降低，不是本題假設下的最佳答案。

（B）frame-shift mutation：移碼突變

此題考驗對細菌轉錄終止 (transcription termination) 機制的理解，特別是與 A:U 配對和 hairpin 結構的關聯。

核心觀念：細菌的轉錄終止主要有兩種機制：Rho-依賴型 (Rho-dependent) 和 Rho-獨立型 (Rho-independent)。Rho-獨立型終止涉及一段富含 G-C 的 DNA 序列，該序列轉錄成 mRNA 後會形成穩定的髮夾結構 (hairpin loop)，後面緊接著一段富含 U 的序列。

詳解：
(A) Rho-dependent termination：此類型的終止依賴於 Rho 因子 (Rho factor) 的作用。Rho 因子是一種 RNA 解旋酶 (helicase)，它結合到新生 RNA 的 C 端，並沿著 RNA 移動，直到遇到 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 停滯的地方，然後解開 RNA-DNA 雜合雙鏈，終止轉錄。它不直接依賴 A:U 配對形成的 hairpin 結構。
(B) TRCF-induced termination：TRCF (Transcription-Coupling Factor) 是一種蛋白質，在某些情況下也參與轉錄終止，但它與 A:U 配對形成的 hairpin 結構無直接關聯。
(C) Rho-independent termination：也稱為內在終止 (intrinsic termination)。這種終止機制不依賴任何額外的蛋白質因子。它依賴於 DNA 序列本身。

此題考驗對 RNA 剪接 (RNA splicing) 機制及其相關知識的理解，需要辨別錯誤的敘述。

核心觀念：RNA 剪接是真核生物 mRNA 成熟過程中的重要步驟，目的是移除內含子 (introns) 並連接外顯子 (exons)。剪接過程涉及複雜的分子機器 spliceosome，也存在自我剪接 (self-splicing) 的情況。

詳解：
(A) 典型的RNA splicing 由 spliceosome 來執行 intron 切除：這是正確的。在真核生物中，大多數 pre-mRNA 的剪接是由一個大型的核糖核蛋白複合物 spliceosome 完成的，它由 snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins) 和其他蛋白質組成。
(B) type II self-splicing 結果會產生 RNA lariat：這是正確的。Type II self-splicing 是一種 RNA 分子自身的催化反應，不需要 spliceosome。在剪接過程中，會形成一個 Lariat (繩圈狀) 的中間產物，其中內含子的 5' 端與內含子內部的一個分支點腺苷酸 (branching adenine) 的 2' 位羥基形成一個 2'-5' 磷酸二酯鍵，形成一個類似繩圈的結構。

核心觀念

這題考基因表現示意圖的判讀：DNA 上的外顯子與內含子經轉錄後，前驅 mRNA 會移除內含子並接合外顯子；成熟 mRNA 的部分區段不會翻譯成蛋白質，接合處也會留下剪接相關標記。

解題方法

先對照三層結構：DNA、剪接後的 mRNA，以及翻譯形成的蛋白質。DNA 上標示 E1–E4 的區段是外顯子，外顯子之間未標示的區段是內含子；成熟 mRNA 上外顯子彼此相接，未翻譯區則位於蛋白質翻譯起點之前或終點之後。

• ①：啟動子（promoter），位於基因上游，負責調控轉錄起始。
• ②：5′ 非翻譯區（5′ UTR），位於 mRNA 的 5′ 端與蛋白質翻譯起點之間。
• ③：外顯子—外顯子接合處（exon–exon junction）。

核心觀念

RNA polymerase II（Pol II）最大次單元末端有一段羧基端結構域（CTD），由多個七胜肽重複序列組成，保守序列為 Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser（YSPTSPS）。CTD 上的胺基酸會隨轉錄進程受到不同程度的磷酸化，形成動態的結合平台，依序招募或釋放轉錄與 RNA 加工因子，將轉錄與新生前驅 mRNA 的加工協調起來。CTD 結構與轉錄週期研究

解題方法

依轉錄流程整理 CTD 的作用：從轉錄起始、延伸到轉錄終止，說明磷酸化狀態如何改變，以及各階段會招募哪些加工因子。

1. **起始階段：**轉錄起始前，CTD 較少磷酸化，有利於 Pol II 與轉錄起始複合體組裝。起始後，TFIIH 的激酶活性使 CTD 的 Ser5 磷酸化，促進 Pol II 離開啟動子並進入轉錄延伸。
2. **5′端加帽：**Ser5 磷酸化可招募加帽酵素至 Pol II。當新生 RNA 的 5′端伸出聚合酶後，加帽酵素便能迅速加上 5′帽。加帽酵素與 Ser5 磷酸化研究

核心觀念

Wobble theory（擺動假說）由 Crick 提出，用來解釋為何細胞中的 tRNA 種類少於可編碼胺基酸的密碼子種類。遺傳密碼具有簡併性，多個密碼子可指定同一胺基酸；其中不少同義密碼子只在第 3 個鹼基不同。

密碼子與反密碼子以反向平行方式配對。密碼子的第 1、2 個鹼基通常採嚴格的標準鹼基配對；密碼子第 3 個鹼基與反密碼子第 1 個鹼基（反密碼子以 $5' \to 3'$ 方向表示）則可發生較有彈性的配對，稱為 wobble 配對。

配對規則與解題方法

判斷 wobble 時，先確認反密碼子的方向，再看它 $5'$ 端的鹼基如何與密碼子第 3 個鹼基配對。常見配對如下：

核心觀念

真核細胞多數 mRNA 以 5′ 端帽結構依賴型轉譯起始進行：起始因子辨識 mRNA 的帽結構，招募核糖體小次單位，再由核糖體掃描至起始密碼子。病毒可利用宿主核糖體與轉譯起始因子合成病毒蛋白，也可改變宿主轉譯環境，讓病毒 mRNA 更容易被翻譯。

常見策略包括：

• 內部核糖體進入位點（IRES）：讓核糖體直接在 mRNA 內部特定位點起始，不必依賴典型的 5′ 端帽結構辨識。
• 劫持宿主 mRNA 的帽結構：病毒將宿主 RNA 的帽結構接到病毒 mRNA 上，使病毒 mRNA 能利用宿主的帽結構依賴型轉譯起始。
• 抑制宿主 mRNA 的轉譯：病毒削弱宿主 mRNA 的轉譯，使細胞資源較集中於病毒蛋白合成。

解題方法

題目要求「試舉例」，作答時可挑選不同病毒及其分子機制，說明病毒如何使用或改造宿主的轉譯系統。最清楚的答法是列出病毒名稱、作用機制，以及此機制對病毒蛋白合成的效果。

1. 小 RNA 病毒，例如脊髓灰質炎病毒：病毒 RNA 帶有 IRES，可招募核糖體進行帽結構非依賴型轉譯。病毒蛋白酶會切割宿主轉譯起始因子 eIF4G，抑制許多宿主 mRNA 的帽結構依賴型轉譯；病毒 RNA 的 IRES 仍可支持病毒蛋白合成，因此轉譯優勢轉向病毒。脊髓灰質炎病毒與其他小 RNA 病毒的 IRES 及 eIF4G 切割機制已有研究記載。

核心觀念

本題考查「DNA 損傷如何形成突變，以及細胞如何在損傷被複製固定成突變前加以修復」。DNA 損傷是鹼基或骨架發生化學改變；突變則是 DNA 序列改變，若損傷未被正確修復而經複製固定，就可能成為突變。細胞主要依損傷的型態，使用校對、錯配修復、鹼基切除修復、核苷酸切除修復、直接修復，以及雙股斷裂修復等機制。NCBI《Molecular Biology of the Cell：DNA Repair》

解題方法

先將突變來源分成內源性錯誤與外源性傷害，再依 DNA 問題的型態配對修復機制：複製時配錯鹼基由校對或錯配修復處理；單一鹼基化學受損多由鹼基切除修復處理；造成雙股螺旋明顯扭曲的損傷多由核苷酸切除修復處理；雙股斷裂則由同源重組或非同源末端接合修復。

A. 內源性錯誤與修正機制（8 分）

可能的內源性錯誤

1. DNA 複製錯誤：DNA 聚合酶可能掺入錯誤鹼基，或因重複序列滑動造成小片段插入、缺失。
2. 鹼基自發性水解：去嘌呤作用會使腺嘌呤或鳥嘌呤脫落，形成無鹼基位點；去胺作用可使胞嘧啶變成尿嘧啶，或使其他鹼基發生去胺變化。
3. 氧化性損傷：細胞代謝產生的活性氧可氧化鹼基，例如形成 8-氧代鳥嘌呤；該鹼基可能錯誤地與腺嘌呤配對。
4. 內源性烷基化：細胞內反應性代謝物可將烷基加到 DNA 鹼基上，改變其配對性質。

對應的修正機制

• DNA 聚合酶校對：DNA 合成時，聚合酶以其校對活性移除新生股末端錯配的核苷酸，再重新合成正確序列。
• 錯配修復（MMR）：校對後仍留下的錯配或小型插入、缺失，由錯配修復辨認新生 DNA 股上的錯誤區段，切除後以正確股為模板重新合成。
• 鹼基切除修復（BER）：DNA 糖基化酶辨認受損鹼基並將其移除，形成無鹼基位點；接著由核酸內切酶切開 DNA，DNA 聚合酶補入正確核苷酸，DNA 連接酶封口。此路徑可修復去胺、氧化、部分烷基化損傷及無鹼基位點。
• 直接修復：部分烷基化損傷可由烷基轉移酶或去烷基化酶直接逆轉，無須切除 DNA 片段。人類的 O⁶-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶可移除 O⁶-甲基鳥嘌呤上的甲基。

B. 外源性傷害與修復機制（12 分）

可能的外源性傷害

1. 紫外線：可使相鄰嘧啶形成環丁烷嘧啶二聚體或 6–4 光產物，造成 DNA 螺旋扭曲。
2. 游離輻射：例如 X 射線、伽馬射線，可直接造成 DNA 斷裂，也可經由水分子產生自由基，造成鹼基氧化及單股或雙股斷裂。
3. 化學致突變物：

核心觀念

本題考查乳糖操縱組的負向調控與正向調控，以及藍白斑篩選中誘導劑與呈色底物的作用。乳糖操縱組的結構基因由同一啟動子轉錄成多順反子 mRNA；調控蛋白則可促進或阻礙轉錄。

解題方法

依原圖由左至右可讀到 lacI、CAP site、Promoter、Operator、lacZ、lacY、lacA；圖下注明 CAP 是分解代謝物活化蛋白。作答時先區分調控基因與操縱組的轉錄控制區，再說明三個結構基因的產物及功能。

(A) 各元件的角色

• lacI：編碼乳糖阻遏蛋白。沒有乳糖時，阻遏蛋白會結合 operator，阻擋 RNA 聚合酶轉錄結構基因。乳糖衍生物異乳糖可與阻遏蛋白結合，使其離開 operator。
• CAP site：CAP-cAMP 複合體的結合位置。葡萄糖濃度低時，細胞內 cAMP 上升並與 CAP 結合；複合體結合此處後可協助 RNA 聚合酶啟動轉錄，提升乳糖操縱組的表現。
• Promoter（啟動子）：RNA 聚合酶辨認並結合的位置，是轉錄起始所需的 DNA 區域。
• Operator（操縱序列）：阻遏蛋白的結合位置。阻遏蛋白結合時抑制下游結構基因的轉錄。
• lacZ：編碼 β-半乳糖苷酶，可分解乳糖，也能將部分乳糖轉成異乳糖。
• lacY：編碼乳糖通透酶，協助乳糖進入細胞。
• lacA：編碼半乳糖苷轉乙醯酶，參與半乳糖苷的乙醯化。

核心觀念

「訊息傳遞」（signal transduction）是細胞將外界或細胞內的訊號轉換成特定細胞反應的過程。真核細胞通常透過受體辨識訊號，再由細胞內的訊息分子逐級傳遞、放大與整合，最後改變蛋白質活性、基因表現或細胞行為。

典型過程可概括為：

解題方法

本題要求描述整體過程，宜依訊號由細胞外傳至細胞反應的順序作答，並補充受體種類、細胞內傳遞機制，以及訊號如何關閉。

1. 訊號辨識與受體活化

訊號分子（ligand）與受體（receptor）專一性結合，使受體構形或活性改變。受體的位置取決於訊號分子的性質：

• 細胞膜受體：接受不易穿過細胞膜的訊號，例如胜肽類荷爾蒙、生長因子與神經傳導物質。
• 細胞內受體：接受可穿過細胞膜的訊號，例如類固醇荷爾蒙。配體與受體結合後，複合體可進入細胞核或直接作用於核內，調節基因轉錄。

2. 細胞內傳遞、放大與整合

受體活化後，會透過細胞內訊息分子傳遞訊號。常見機制包括：

• 蛋白質磷酸化級聯：蛋白質激酶依序磷酸化下游蛋白，改變其活性；蛋白質磷酸酶則移除磷酸基，協助調控訊號。
• 第二訊息分子：例如環腺苷酸（cAMP）、鈣離子（Ca²⁺）、肌醇三磷酸（IP₃）與二酸甘油酯（DAG）。它們在細胞內傳遞訊號，並可活化下游酵素或調節蛋白。

一個受體活化可引發多個下游分子依序活化，因此能放大原始訊號。細胞也可整合來自不同受體的訊息，使反應受到其他訊號及細胞狀態調節。

3. 產生特定細胞反應

核心觀念

本題考查在哺乳類細胞中降低特定基因表現，以觀察其功能的「基因沉默」策略，以及如何確認沉默確實發生。基因沉默可作用於不同層次：

• 轉錄後抑制：降低目標 mRNA 的穩定性或翻譯效率，例如 RNA 干擾。
• 轉錄抑制：抑制目標基因的轉錄，例如 CRISPRi。
• 基因破壞：用基因編輯造成突變，使功能性蛋白質減少或消失，例如 CRISPR-Cas9 knockout。這是基因功能研究的常用方法，但嚴格而言屬於基因破壞，不是單純的表現抑制。

「敲低」（knockdown）通常指表現量降低；「敲除」（knockout）則指基因功能遭破壞。研究設計應依問題所需選擇策略。

解題方法

1. 選擇基因沉默技術

RNA 干擾：siRNA 或 shRNA

siRNA 轉染入細胞後，會進入 RNA 誘導沉默複合體（RISC）。其中的導引股辨識互補的目標 mRNA，使其被切割或抑制翻譯，降低目標蛋白質表現。siRNA 適合短期、暫時性敲低；shRNA 由表現載體或病毒載體持續產生，可形成 siRNA 樣分子，適合較長期的敲低。

設計時應選擇目標基因中具專一性的序列，並使用非標靶 siRNA 或 shRNA 作為陰性對照。

CRISPRi

CRISPRi 使用失去切割能力的 dCas9，搭配辨識目標啟動子或轉錄起始點附近序列的導引 RNA；dCas9 常與 KRAB 等轉錄抑制結構域融合，藉由阻礙轉錄或建立抑制性染色質狀態，降低目標基因轉錄。此法不需切割 DNA，適合抑制基因表現而保留基因組序列。

反義寡核苷酸

反義寡核苷酸可與目標 RNA 配對，依其化學修飾與設計，促進 RNA 降解或阻斷 RNA 的加工、轉譯等過程。此法也可用於降低特定轉錄本的表現。

CRISPR-Cas9 基因敲除

若研究需要去除基因功能，可利用 Cas9 導致 DNA 雙股斷裂，再由細胞修復造成插入或缺失突變，使編碼序列移碼或破壞重要區域。此法通常造成較長期的功能缺失，但與短期、可逆的敲低不同，也需考慮細胞是否出現補償性反應。

2. 設計對照並確認效果

核心觀念

電泳遷移率變動分析（EMSA）用來判斷蛋白質是否與特定 DNA 片段結合。游離 DNA 通常跑得較快；蛋白質結合 DNA 後，複合體較大，移動較慢，因此在膠上形成較高位置的位移帶。若加入另一種蛋白質後出現更慢的帶，表示可能形成了含有該蛋白質的較大複合體。

解題方法

圖中第 1 道未加蛋白質，作為游離 DNA 對照；第 2、3、4 道分別加入 Protein A、B、C；第 5、6、7 道分別加入 A+B、A+C、B+C。A 單獨加入時出現位移帶；B 或 C 單獨加入時沒有明顯位移。A+B 道出現比 A 單獨時更慢的帶，A+C 道則仍呈現與 A 單獨相近的位移；B+C 道沒有明顯位移。

判讀時先比較各蛋白質單獨加入的結果，再比較混合加入後是否出現新的位移帶，以推論蛋白質與 DNA 或彼此之間的結合關係。

（A）Protein B 如何活化轉錄

A 單獨能與 Gene X 上游的調控 DNA 結合，形成位移帶；B 單獨沒有造成 DNA 位移，表示在此實驗條件下，B 沒有直接結合該 DNA 的證據。A+B 道出現更慢的複合體，支持 B 能與已結合 DNA 的 A 共同形成較大的複合體。

因此，可提出的模型是：A 作為 DNA 結合蛋白，先辨識並結合 Gene X 上游調控序列，再招募 Protein B；

核心觀念

本題考查如何依突變的型態選擇分子檢測方法。不同突變會造成不同訊號：點突變改變鹼基序列；小片段插入或刪除改變 DNA 長度與序列；基因擴增增加基因拷貝數；染色體轉位改變染色體片段的位置，常形成融合基因。檢測方法的原理，就是把這些差異轉換成可觀察的序列、長度、拷貝數或染色體位置訊號。

解題方法

一、點突變（point mutation）

點突變是單一鹼基的置換，可造成同義突變、錯義突變或無義突變。由於 DNA 片段長度通常不變，檢測重點是確認鹼基序列差異。

• **DNA 定序：**PCR 擴增目標區域後，以 Sanger 定序或次世代定序讀取序列，再與參考序列比對，確認突變位置與鹼基變化。Sanger 定序適合分析特定區域；次世代定序可同時檢查大量基因或樣本。
• **等位基因專一性 PCR（allele-specific PCR／ARMS）：**設計引子，使引子末端鹼基對應野生型或突變型。引子末端與模板完全配對時可有效延伸；末端不配對時，擴增效率會大幅降低。依是否出現預期產物判定等位基因型態。此法適合檢測已知突變。
• **限制酶片段長度分析（RFLP）：**若點突變使限制酶辨識序列消失或產生，可用該酶切割 PCR 產物，再以電泳觀察片段長度。突變型與野生型會呈現不同的酶切圖譜。
• **高解析熔解曲線分析（HRM）：**PCR 後逐漸升高溫度，監測雙股 DNA 解鏈時的螢光變化。鹼基差異會改變 DNA 雙股的熔解特性，形成不同熔解曲線，可用來篩檢序列變異，並以定序確認。

二、小片段插入與刪除（small insertion／deletion）

小片段插入或刪除會改變 DNA 長度，也可能造成讀碼框移位。在編碼區中，若變化的鹼基數不是 3 的倍數，通常會改變下游胺基酸序列。

• **PCR 搭配凝膠或毛細管電泳：**使用包夾變異位置的引子進行 PCR，再依產物長度差異判讀。毛細管電泳的解析度較高，適合分辨較短的長度差異；若只差一至數個鹼基，普通瓊脂糖凝膠的解析度不足。
• **DNA 定序：**直接確認插入或刪除的位置、鹼基數及其對讀碼框的影響。雜合檢體的兩種等位基因長度不同時，變異區附近可能出現混合訊號。

三、基因擴增（gene amplification）

核心觀念

本題考查如何用細胞內基因功能操作，測量細胞生長與分裂，並以適當對照判斷新基因是否造成改變。單純觀察基因表現量與細胞數同時變化，只能顯示相關性；要支持因果關係，須操作基因表現，再觀察細胞增殖指標是否改變。

細胞數變化同時受到細胞分裂與細胞死亡影響，因此至少要量測細胞數，並搭配細胞週期或 DNA 合成指標；同時檢查細胞死亡，可避免把存活率變化誤判為分裂速度改變。

細胞增殖速率可用特定生長速率表示：

其中 $N_0$ 為起始細胞數，$N_t$ 為時間 $t$ 後的細胞數。若細胞處於指數生長期，倍增時間為：

解題方法與實驗設計

採用「過度表現、抑制表現、救援實驗」三種操作，再以細胞數、DNA 合成及細胞週期分析檢驗表型。過度表現測試增加基因表現是否改變增殖；基因抑制測試內源性基因是否參與增殖；救援則確認抑制造成的表型是否由目標基因特異性引起。

一、選擇細胞與準備材料

1. 選擇與研究背景相符、可有效轉染且表現該基因的哺乳類細胞株；使用前確認細胞無黴漿菌污染，並維持在對數生長期。
2. 以 RT-qPCR 檢測細胞中的內源性目標 mRNA，確認所選細胞株適合進行抑制表現實驗。
3. 準備下列材料：
   • 細胞培養基、血清、抗生素及胰蛋白酶。
   • RNA 萃取試劑、反轉錄試劑及即時定量 PCR 試劑。
   • 目標基因表現質體、空載體、目標基因 siRNA 與非靶向 siRNA。
   • 細胞轉染試劑、EdU 試劑、細胞週期染色試劑及細胞死亡分析試劑。
   • 細胞計數器或血球計數盤、螢光顯微鏡或流式細胞儀。

二、製備並確認目標基因表現質體

1. 依已知 mRNA 序列確認欲表現的轉錄本及蛋白質編碼區。
2. 以涵蓋完整編碼區的引子，從細胞 cDNA 擴增目標基因；亦可依序列合成 cDNA。
3. 將編碼區接入真核表現載體，使其受適當啟動子控制。空載體作為對照。
4. 定序確認插入片段的序列、方向及閱讀框正確。
5. 以 RT-qPCR 檢查轉染後目標 mRNA；若有適當抗體，另以西方墨點法確認蛋白質表現。

三、建立實驗組與對照組

分別進行以下操作，避免將不同轉染條件混為一組：

• **過度表現組：**目標基因表現質體。
• **過度表現對照組：**等量空載體。
• **基因抑制組：**目標基因 siRNA。
• **基因抑制對照組：**非靶向 siRNA。
• **救援組：**目標基因 siRNA 加上可抗 siRNA 辨識的目標基因表現質體。
• **救援對照組：**目標基因 siRNA 加空載體。

核心觀念

次世代定序（NGS）的核心，是把大量 DNA 片段平行讀取，再以電腦將讀序整理、比對或組裝成生物學資訊。描述一種平台時，可依序說明三個環節：文庫如何製備與擴增、定序時如何辨認核苷酸、訊號如何轉成鹼基序列。

以下以 Illumina 合成定序法與 Ion Torrent 半導體定序法為例。兩者都以 DNA 聚合酶延伸新股來取得序列，主要差別在於讀取訊號：Illumina 讀取螢光訊號，Ion Torrent 讀取核苷酸掺入時造成的氫離子與 pH 變化。

解題方法

申論題應對兩種平台使用相同的比較架構：先交代樣本如何形成大量可讀取的模板，再說明每輪如何判讀鹼基，最後整理各自的優缺點與適用研究。這樣能清楚呈現「定序化學如何決定平台特性」，避免只列出儀器名稱。

平台一：Illumina 合成定序法

原理

1. **製備文庫：**將 DNA 打斷成適當長度的片段，在兩端接上接頭；接頭可供文庫固定、擴增與定序引子結合。
2. **形成克隆群集：**文庫片段固定於流動槽表面，藉由橋式 PCR 在原位擴增。同一位置形成大量源自同一片段的 DNA 拷貝，稱為群集（cluster）。
3. **逐鹼基合成與判讀：**加入 DNA 聚合酶與帶有螢光標記的可逆終止核苷酸。每輪掺入一個核苷酸後，影像系統讀取螢光訊號以判定鹼基；接著移除螢光標記與終止基團，恢復延伸能力，再進入下一輪。Illumina 的定序合成法以可逆終止核苷酸逐鹼基讀取序列。Illumina 定序技術說明
4. **讀取兩端：**若採雙端定序，可從片段一端讀取後，再以另一端為起點讀取，取得同一片段兩端的序列資訊。

優點

• 可同時讀取大量 DNA 片段，定序通量高，適合大規模研究。
• 逐輪只掺入一個鹼基，鹼基判讀準確度高；此種方式也降低了連續相同鹼基造成的長度判讀問題。Illumina 定序技術優點說明
• 每個鹼基的定序成本通常較低，適合全基因體、外顯子體與轉錄體等大規模分析。
• 雙端讀序有助於比對與辨識部分插入、缺失或轉位等變異。

缺點

• 讀序相對較短，遇到重複序列、複雜結構變異或基因組組裝時，較難判定片段在基因組中的位置。
• 文庫製備與 PCR 擴增可能造成序列覆蓋偏差；GC 含量極高或極低的區域也可能不易被均勻讀取。
• 需要螢光成像及多輪流體操作，儀器與資料分析需求較高。

常見應用

全基因體定序、外顯子體定序、RNA-seq 基因表現分析、癌症基因變異分析、微生物基因組分析、宏基因組分析與表觀基因體研究。

平台二：Ion Torrent 半導體定序法

原理