109 年 國立臺灣大學醫學檢驗暨生物技術學系碩士班（一般生）《分子生物學（C）》

此題主要在考驗學生對即時定量聚合酶鏈鎖反應 (RT-qPCR) 的基本原理、關鍵指標 Ct 值的意義，以及如何利用實驗數據進行定量分析。

(A) 即時定量聚合酶鏈鎖反應 (RT-qPCR) 的原理：
RT-qPCR 的原理是將 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 與 qPCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) 結合。首先，透過反轉錄酶 (reverse transcriptase) 將 RNA 模板反轉錄成 cDNA (complementary DNA)。接著，利用 PCR 技術對 cDNA 進行指數級的複製。在 PCR 過程中，會加入螢光染劑 (如 SYBR Green) 或螢光標記的探針，這些螢光物質會在 DNA 聚合酶複製 DNA 時與新合成的雙股 DNA 結合，進而產生螢光訊號。PCR 進行的循環數越多，螢光訊號就越強。即時定量 PCR 儀器會即時監測螢光訊號的變化，並記錄其隨 PCR 循環數的增加而累積的量。透過監測螢光訊號的變化，可以在 PCR 過程的早期階段就偵測到目標 DNA 的存在，並根據螢光訊號的強度來推估目標 DNA 的初始含量。

(B) Ct 值的意義：
Ct 值 (Cycle threshold) 是指在 PCR 擴增過程中，螢光訊號首次達到預設的閾值 (threshold) 時所需的循環數。這個閾值通常設定在螢光訊號開始呈現指數級增長的對數階段。Ct 值與目標 DNA 模板的初始濃度呈反相關關係。也就是說，初始模板濃度越高，達到閾值所需的循環數就越少，Ct 值就越低；反之，初始模板濃度越低，達到閾值所需的循環數就越多，Ct 值就越高。因此，Ct 值可以被用來定量分析樣本中目標核酸的初始含量。

(C) 本次實驗,細胞在經由藥物處理後,gene A表現量如何改變?
在進行定量分析前，通常會先進行 RNA 的反轉錄，並利用內生對照 (internal control, 如 housekeeping gene) 來校正樣本間 RNA 總量或反轉錄效率的差異。內生對照的 Ct 值應該在實驗組和對照組之間差異不大，以確保實驗的可靠性。

從圖中可以看出：
實驗組 gene A 的 Ct 值為 18.9。
對照組 gene A 的 Ct 值為 27.1。

我們需要計算 gene A 在實驗組相對於對照組的表現量變化。通常使用 $\Delta \Delta Ct$ (delta-delta Ct) 方法進行定量分析。
步驟如下：

1. 計算 $\Delta Ct$ (delta Ct)：
   $\Delta Ct$ 表示目標基因 (gene A) 相對於內生對照 (internal control) 的 Ct 值差異。
   $\Delta Ct_{sample} = Ct_{gene A, sample} - Ct_{internal control, sample}$

   在本次實驗中，我們需要分別計算實驗組和對照組的 $\Delta Ct$。
   實驗組：$\Delta Ct_{experiment} = Ct_{gene A, experiment} - Ct_{internal control, experiment}$
   $\Delta Ct_{experiment} = 18.9 - 15.3 = 3.6$

   對照組：$\Delta Ct_{control} = Ct_{gene A, control} - Ct_{internal control, control}$
   $\Delta Ct_{control} = 27.1 - 22.7 = 4.4$

2. 計算 $\Delta \Delta Ct$ (delta-delta Ct)：

此題主要考驗學生對 Western Blot 技術的理解，包含其偵測對象、基本原理與步驟，以及實驗操作中的注意事項。

(A) 西方點墨法是針對何種物質(標的)進行偵測並分析?
西方點墨法 (Western Blot) 的主要偵測對象是 蛋白質。透過使用對特定蛋白質具有高專一性的抗體，來偵測和分析樣本中的目標蛋白質。

(B) 西方點墨法的原理與步驟為何?
原理：
Western Blot 的原理是利用電泳技術將蛋白質樣本分離，然後將分離後的蛋白質轉漬 (blotting) 到一個固態載體 (如 PVDF 或硝纖維膜) 上。接著，利用對目標蛋白質具有特異性結合能力的抗體 (第一抗體) 來辨識和結合目標蛋白質。最後，利用帶有酵素或螢光標記的第二抗體，該第二抗體能結合第一抗體，並透過酵素催化顯色反應或螢光訊號，來偵測和定量目標蛋白質的存在。

步驟：

1. 蛋白質樣本製備 (Sample Preparation)： 從細胞或組織中萃取出總蛋白質，並進行定量。
2. 蛋白質分離 (Protein Separation)： 使用 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 將蛋白質根據其分子量大小進行分離。SDS 會使蛋白質帶負電，並破壞蛋白質的二級和三級結構，使其僅依分子量移動。
3. 蛋白質轉漬 (Protein Transfer / Blotting)： 將 SDS-PAGE 膠體中的蛋白質轉移 (電轉) 到一個固態膜 (如 PVDF 或硝纖維膜) 上。這個步驟是將蛋白質從易碎的凝膠轉移到更穩定、易於操作的膜上，以便後續的抗體結合。
4. 膜的阻斷 (Blocking)： 在轉漬完成後，使用非特異性蛋白質 (如脫脂奶粉或 BSA, Bovine Serum Albumin) 來阻斷膜上所有未被蛋白質結合的位點。這是為了防止後續使用的抗體與膜發生非特異性結合，從而減少背景訊號。
5. 第一抗體孵育 (Primary Antibody Incubation)： 將對目標蛋白質具有專一性結合能力的「第一抗體」加入，使其與膜上的目標蛋白質結合。孵育時間和溫度需根據抗體說明書進行。
6. 清洗 (Washing)： 用緩衝液 (如 PBST, Phosphate-Buffered Saline with Tween-20) 清洗膜，移除未結合的第一抗體。
7. 第二抗體孵育 (Secondary Antibody Incubation)： 加入「第二抗體」，該抗體能辨識並結合第一抗體 (通常是結合第一抗體的 Fc 片段)。第二抗體通常帶有酵素 (如 HRP, Horseradish Peroxidase 或 AP, Alkaline Phosphatase) 或螢光標記。
8. 清洗 (Washing)： 再次用緩衝液清洗膜，移除未結合的第二抗體。
9. 訊號偵測 (Signal Detection)：
   • 酵素標記： 加入酵素的顯色底物 (substrate)。酵素會催化底物產生可見的顏色沉澱，或者與化學冷光試劑反應產生光訊號。
   • 螢光標記： 直接使用螢光掃描儀偵測螢光訊號。
10. 結果判讀 (Result Interpretation)： 根據偵測到的訊號位置和強度，判斷目標蛋白質是否存在、分子量以及相對含量。

(B) 西方點墨法的原理與步驟為何? (可圖示說明，在此以文字描述流程)
原理：將蛋白質經 SDS-PAGE 分離後，轉移至膜上，再利用特異性抗體 (第一抗體) 結合目標蛋白質，最後透過標記的第二抗體偵測目標蛋白質。
步驟：

此題考驗學生對 Pyrosequencing 技術的原理、結果判讀以及其優缺點的了解。

A. 請問焦磷酸定序的原理為何?
Pyrosequencing 的原理是基於 DNA 聚合酶催化dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) 加入到互補鏈時，釋放出焦磷酸 (pyrophosphate, PPi)。其基本流程如下：

1. 模板製備： 將單股 DNA 模板連結上接頭 (adapter)，然後固定在微小的磁珠 (beads) 上。
2. 聚合酶鏈鎖反應 (PCR) 擴增： 在磁珠上進行 in vitro PCR 擴增，產生大量目標 DNA 拷貝。
3. 酶促反應與訊號偵測： 將 PCR 產生的單股 DNA 模板與 DNA 聚合酶、硫代硫酸鹽 (APS, adenosine 5'-phosphosulfate) 和螢光素酶 (luciferase) 等酶結合。
4. 逐一加入 dNTPs： 系統會依序加入四種 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 到反應體系中。
5. 焦磷酸釋放與訊號產生： 當 DNA 聚合酶將正確的 dNTP 加入到 DNA 鏈上時，會釋放出焦磷酸 (PPi)。
6. ATP 產生與螢光訊號： 釋放出的 PPi 會被 ATP 硫化酶 (ATP sulfurylase) 轉化為 ATP。ATP 則會被螢光素酶催化，進而產生螢光訊號。
7. 訊號強度與鹼基數量成正比： 產生的螢光訊號強度與被加入的 dNTP 數量成正比。例如，如果連續加入兩個相同的 dNTP (如 dGTP)，則會釋放出兩個 PPi，產生雙倍的 ATP 和雙倍的螢光訊號。
8. 訊號記錄： 儀器會即時記錄不同 dNTP 加入時所產生的螢光訊號峰值。
9. 鹼基序列推斷： 透過分析不同 dNTP 加入時的螢光訊號峰值序列，就可以推斷出 DNA 模板的鹼基序列。例如，如果加入 dATP 時出現訊號峰，表示該位置是 A；如果連續加入兩個 dGTP 時出現較高的訊號峰，表示該位置是 GG。

B. 一研究生以焦磷酸定序法完成一片段核酸序列的檢測,如下。請問根據此結果,請列出此片段的DNA序列結果。
題目提供的圖形是 Pyrosequencing 的訊號圖，橫軸代表加入不同 dNTP 的循環次數（或時間），縱軸代表螢光訊號強度。常見的訊號圖會顯示不同鹼基（A, T, C, G）的縮寫，並在加入該鹼基時顯示訊號峰。

根據標準的 Pyrosequencing 訊號圖判讀規則：

• 訊號峰出現在某個 dNTP 加入時，表示該位置是該鹼基。
• 訊號峰的高度與該位置連續重複的相同鹼基數量成正比。

題目中給出的序列是「AGCTAGCTAGCTAGCT」，這代表了研究者預期或已知的序列，但我們需要根據訊號圖來推斷實際的定序結果。由於題目中沒有提供實際的訊號圖，而是直接給出一個已知的序列，並要求根據「此結果」列出 DNA 序列，這暗示我們應該直接將題目提供的序列作為結果。

此題考驗學生對 DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 在 DNA 複製過程中維持準確性的機制及其貢獻的理解。

DNA 聚合酶在複製過程中維持極高的準確性，其錯誤率約為 $10^{-7}$ (每 $10^7$ 個鹼基才出一個錯)。這種準確性主要歸功於兩種機制：

1. 校對功能 (Proofreading Activity)：

   • 機制： 大多數 DNA 聚合酶都具有 $3' \to 5'$ 核酸外切酶活性 (exonuclease activity)，這就是其校對功能。當 DNA 聚合酶將一個錯誤的鹼基錯配 (mismatch) 加入到新生鏈時，這個錯誤的鹼基會扭曲 DNA 雙螺旋結構，並阻礙 DNA 聚合酶的進一步前進。此時，DNA 聚合酶會停止延伸，並利用其 $3' \to 5'$ 核酸外切酶活性，將錯誤的鹼基從新生鏈的 $3'$ 端切除。切除錯誤鹼基後，DNA 聚合酶會重新嘗試將正確的鹼基加入，然後繼續延伸。
   • 貢獻： 校對功能是 DNA 複製準確性最重要的來源之一。它能將 DNA 聚合酶的原始錯誤率 (約 $10^{-4}$ 至 $10^{-5}$) 大幅降低。研究表明，單靠校對功能，可以將錯誤率降低約 100 到 1000 倍。

2. 錯配修復系統 (Mismatch Repair System, MMR)：

   • 機制： 雖然 DNA 聚合酶的校對功能非常有效，但仍會有極少數的錯誤鹼基未能被及時切除。此時，細胞內的錯配修復系統 (MMR) 會介入。MMR 系統能夠識別 DNA 鏈上新合成的區域（相較於模板鏈，新生鏈通常有標記，例如在原核生物中是通過 DNA 甲基化狀態，而在真核生物中則可能與複製叉的運動相關），並切除錯配的鹼基及其周圍的一小段 DNA。

此題考驗學生對 DNA 甲基化 (DNA methylation) 在細菌中的功能，特別是 Dam methylase 的作用。

Dam methylase (Deoxyadenosine methylase) 是一種細菌特有的 DNA 甲基轉移酶，它專一性地識別 DNA 序列 5'-GATC-3' 中的腺嘌呤 (Adenine, A)，並在其 N6 位置加上一個甲基基團，形成 N6-methyladenosine ($m^6A$)。這種甲基化發生在新合成的 DNA 鏈上，因為模板鏈的 GATC 序列可能已經是甲基化的，而新合成的鏈在複製後剛開始是未甲基化的。

DNA methylation (Dam methylation) 的至少兩項生理功能及機制：

1. 區分親代與子代 DNA (Distinguishing Parental vs. Newly Synthesized DNA)：
   • 機制： 在細菌 DNA 複製過程中，親代 DNA 鏈上的 GATC 序列通常是甲基化的，而新合成的子代 DNA 鏈上的 GATC 序列在複製完成後最初是未甲基化的。Dam methylase 會在幾分鐘內將新合成鏈上的 A 甲基化，恢復 GATC 位點的雙鏈甲基化狀態。這種暫時的半甲基化狀態 (hemimethylation) 非常重要。
   • 生理功能：
     • DNA 複製起始的時機控制 (Timing of DNA Replication Initiation)： 嚴格的甲基化/去甲基化週期對於確保 DNA 複製只發生一次至關重要。只有當親代和子代鏈都完成甲基化後，DNA 複製才能再次啟動。
     • DNA 修復 (DNA Repair)： 半甲基化狀態使得 DNA 修復系統 (特別是錯配修復系統, Mismatch Repair, MMR) 能夠區分親代鏈和子代鏈。MMR 系統會優先識別並修復子代鏈上的錯誤，因為子代鏈暫時是未甲基化的。這對於維持基因組的準確性至關重要。

此題考驗學生對 CpG 甲基化在人類基因體中的生物學意義，以及 5-methylcytidine 成為突變熱點的原因。

A. 產生 5-methylcytidine 的生物學意義：
CpG 甲基化 (在 CpG dinucleotides 的 Cytosine 上加上甲基) 是哺乳動物基因組中最常見的表觀遺傳修飾之一，具有多方面的生物學意義：

1. 基因表達調控 (Gene Expression Regulation)：

   • 機制： CpG 區域，特別是啟動子區域富含 CpG 的區域 (CpG islands)，在未甲基化時通常與轉錄因子結合，促進基因轉錄。當 CpG islands 被甲基化時，甲基基團會妨礙轉錄因子 (如 Sp1) 的結合，同時也可能招募甲基化 CpG 結合蛋白 (MBDs, Methyl-CpG-binding domain proteins)，這些蛋白進一步招募組蛋白去乙醯化酶 (HDACs)，導致染色質結構變得更緊密 (heterochromatin)，從而抑制基因的轉錄。
   • 意義： 這是維持細胞特異性基因表達模式、基因沉默 (gene silencing) 的重要機制，例如 X 染色體失活 (X-chromosome inactivation)、基因印記 (genomic imprinting) 以及抑癌基因的沉默。

2. 基因組穩定性 (Genomic Stability)：

   • 機制： 甲基化 CpG 位點在防止轉座子 (transposable elements) 和重複序列的活性方面起作用，維持基因組的穩定性。
   • 意義： 阻止有害的基因重組和插入，維持基因組結構的完整性。

3. DNA 修復 (DNA Repair)：

   • 機制： 甲基化 CpG 位點參與某些 DNA 修復途徑，例如錯配修復 (MMR)。
   • 意義： 確保 DNA 複製錯誤得到有效修復。

4. 胚胎發育與分化 (Embryonic Development and Differentiation)：

   • 機制： 廣泛的 DNA 甲基化模式在胚胎發育過程中動態變化，對細胞的決定和分化至關重要。
   • 意義： 建立和維持細胞譜系特異性。

B. 5-methylcytidine 比未甲基化的 cytidine 更容易發生突變的原因：

此題考驗學生對轉譯 (Translation) 過程中關鍵因子的認識，特別是胜肽鍵形成和密碼子-反密碼子配對的機制。

在轉譯過程中，主要由核糖體 (ribosome) 負責催化胜肽鍵的形成，而確保胺基酸與 genetic code 正確配合則是由核糖體、tRNA 及其上的胺基酸所共同完成。

1. 催化胜肽鍵合成 (Catalysis of Peptide Bond Formation)：

   • 負責者： 核糖體 (Ribosome)。
   • 說明： 核糖體由核小體 RNA (rRNA) 和蛋白質組成。其 rRNA 部分，特別是 23S rRNA (在原核生物) 或 28S rRNA (在真核生物) 的大次單元 (large subunit)，具有核酶 (ribozyme) 的活性。這個 rRNA 的活性中心稱為 胜肽酰轉移酶 (peptidyl transferase) 中心。它位於核糖體 P 位 (peptidyl site) 和 A 位 (aminoacyl site) 之間，負責將 P 位上連接的胜肽鏈 (或胺基酸) 的羧基端與 A 位上新結合的胺基酰-tRNA (aminoacyl-tRNA) 的胺基端連接，形成新的胜肽鍵。

2. 確保每個胺基酸能與 genetic code 正確配合 (Ensuring Correct Amino Acid-Genetic Code Pairing)：

   • 負責者： 胺基酰-tRNA 合成酶 (Aminoacyl-tRNA Synthetases, aaRSs) 和 核糖體 (Ribosome)。
   • 說明：
     • 胺基酰-tRNA 合成酶 (aaRSs)： 這是第一道也是最關鍵的篩選關卡。

此題考驗學生對 group I self-splicing intron 的機制理解，以及其與 group II intron 在結構上的差異。

核心觀念： Self-splicing introns 根據其剪接機制和中間產物的結構，主要分為 group I 和 group II 兩類。它們都能在沒有蛋白質催化劑的情況下自行完成剪接，但其反應步驟和中間產物不同。

Group I self-splicing intron 的機制：
Group I intron 的剪接反應通常包含兩個主要的轉酯化反應 (transesterification reactions)，並且使用一個外源性的鳥苷 (Guanosine, G) 作為輔助因子 (cofactor)。

1. 第一個轉酯化反應：

   • 外源性的鳥苷 (G) 的 3'-OH 基團進攻 intron 的 5' 端磷酸二酯鍵。
   • 這個反應會斷開 exon-intron 交界處的磷酸二酯鍵，並將鳥苷連接到 intron 的 5' 端，形成一個 3'-OH-G-intron 的中間產物。
   • 此時，intron 的 5' 端與鳥苷共價連接，而 exon 的 5' 端則帶有自由的 3'-OH 基團。

2. 第二個轉酯化反應：

   • 在第一個反應產生的 3'-OH-G-intron 中，intron 的 3' 端 OH 基團進攻 exon-intron 交界處的 3' 磷酸二酯鍵。
   • 這個反應會斷開 intron 的 3' 端磷酸二酯鍵，同時將 exon 的 5' 端和 3' 端連接起來，形成連接的 exon。
   • intron 本身則以一個線性的、帶有鳥苷在 5' 端（稱為 3'-OH-G-intron）的結構被釋放出來。

為何 type I self-spliced intron 不會形成 lariat 結構？

Lariat 結構 是 Group II self-splicing intron 剪接過程中的一個關鍵中間產物。在 Group II intron 的剪接過程中，intron 的 2'-OH 基團 (通常來自一個特定的腺嘌呤殘基) 進攻 exon-intron 交界處的 5' 磷酸二酯鍵，形成一個 2'-5' 磷酸二酯鍵，將 intron 的 5' 端連接到其內部的一個腺嘌呤的 2' 位羥基上，從而形成一個 分支點 (branch point)，這個結構看起來像一個 繩圈 (lariat)。

此題考驗學生對真核細胞 mRNA 前驅物 (pre-mRNA) 在進入細胞質進行轉譯前所經歷的加工修飾的理解。這些修飾對於 mRNA 的穩定性、運輸和轉譯至關重要。

真核細胞在轉錄後生成的 RNA，通常是初級轉錄產物 (primary transcript) 或稱為前驅物 mRNA (pre-mRNA)。這些 pre-mRNA 需要經過一系列的加工修飾，才能成為成熟的、可供轉譯的 mRNA。主要的修飾包括：

1. 5' 端加帽 (5' Capping)：

   • 機制： 在轉錄剛開始時，pre-mRNA 的 5' 端會被加上一個特殊的結構，即 7-甲基鳥苷 (7-methylguanosine, $m^7G$)。這個帽結構透過一個獨特的 5'-5' 三磷酸鍵 (5'-5' triphosphate linkage) 連接到 pre-mRNA 的第一個核苷酸上。
   • 意義：
     • 保護 5' 端： 防止 5' 端被 5' 核酸酶降解，增加 mRNA 的穩定性。
     • 促進核運輸： 幫助 mRNA 從細胞核運輸到細胞質。
     • 識別起始密碼子： 在細胞質中，核糖體上的起始因子 (initiation factors) 會識別 5' 帽結構，並結合在 5' 帽上，然後掃描尋找起始密碼子 (AUG)。

2. 3' 端加聚腺苷酸尾 (3' Polyadenylation)：

   • 機制： 在 pre-mRNA 的 3' 端，會有多個腺嘌呤核苷酸 (adenine nucleotides) 被聚合酶 (poly-A polymerase) 連續添加，形成一個長度約為 50-250 個核苷酸的聚腺苷酸尾 (poly-A tail)。這個過程通常發生在 pre-mRNA 的一個特定序列 (如 AAUAAA 訊號) 被切割後。
   • 意義：
     • 保護 3' 端： 類似 5' 帽，聚腺苷酸尾也能保護 3' 端免受 3' 核酸酶降解，增加 mRNA 的穩定性。
     • 促進核運輸： 幫助 mRNA 運輸到細胞質。

此題考驗學生對原核生物轉錄終止機制，特別是 Rho-dependent termination 的理解。

Rho (ρ) factor 是一種 ATP 依賴性的 RNA 解旋酶 (RNA helicase)，它介導一種特定的原核轉錄終止機制，稱為 Rho-dependent termination (Rho 依賴性終止)。這種終止機制通常發生在特定的 DNA 序列上，這些序列被稱為 Rho 依賴性終止子 (rho-dependent terminators)。

Rho factor 終止轉錄的作用機制：

1. 識別 Rho 結合位點 (Rho Utilization Site, rut)：

   • Rho factor 的作用始於它識別並結合到正在合成的 mRNA 鏈上的特定序列，稱為 rut 序列 (rho utilization site)。rut 序列通常富含 C 鹼基，並且缺乏鳥苷 (G) 殘基。它通常位於轉錄起始點下游約 70-100 個核苷酸處。
   • Rho factor 結合到 rut 位點後，會開始沿著 mRNA 鏈向 5' 端 (即朝向 RNA 聚合酶) 移動。

2. ATP 水解與移動：

   • Rho factor 的移動是 ATP 依賴性的。當 Rho factor 結合到 mRNA 上後，它會水解 ATP，利用 ATP 水解釋放的能量，使其能夠沿著 mRNA 鏈解旋和移動。

3. 追趕 RNA 聚合酶：

   • 當 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 轉錄到終止子區域時，它會減速或暫時停止。
   • Rho factor 由於 ATP 水解提供的動力，會沿著 mRNA 鏈快速移動，最終追趕上 RNA 聚合酶。

4. 解旋 RNA-DNA 雜合體：

   • 當 Rho factor 追趕上 RNA 聚合酶，並到達 RNA 聚合酶所在的轉錄泡 (transcription bubble) 時，它會利用其 RNA 解旋酶活性。
   • Rho factor 會解開 RNA 聚合酶與 DNA 模板之間的 RNA-DNA 雜合體 (RNA-DNA hybrid)，以及 mRNA 與 DNA 模板之間的氫鍵。

此題考驗學生對真核細胞如何調控轉譯效率的理解，需要舉出一個具體的例子。

真核細胞透過多種機制來調節整體轉譯作用的效率，以適應環境變化和生長需求。這些調控可以發生在轉譯起始、延伸或終止等多個階段。其中，轉譯起始階段的調控是最常見且重要的途徑之一。

調控轉譯效率的一個例子：飢餓狀態下的整合性壓力反應 (Integrated Stress Response, ISR)

在細胞面臨各種壓力，如飢餓 (胺基酸缺乏)、病毒感染、缺氧、DNA 損傷等時，會啟動整合性壓力反應 (ISR)。ISR 的一個關鍵調節點是通過一種稱為 PERK (PKR-like ER kinase) 的蛋白質激酶。

機制：

1. 壓力感知： 當細胞面臨胺基酸缺乏（飢餓）等壓力時，內質網 (ER) 中的 PERK 激酶會被活化。
2. PERK 磷酸化 eIF2α： 活化的 PERK 會磷酸化真核起始因子 2α (eukaryotic initiation factor 2 alpha, eIF2α)。eIF2α 是調節轉譯起始的一個關鍵蛋白質。
3. 抑制轉譯起始： 磷酸化的 eIF2α 會與另一個起始因子 eIF2B (GDP-GTP exchange factor for eIF2) 形成一個穩定的複合物。這種結合會「捕獲」eIF2B，使其無法再生 eIF2α 的活性形式 (eIF2-GTP)。因此，eIF2α-GTP 的可用量急劇減少。
4. 整體轉譯效率下降： eIF2α-GTP 是啟動所有 mRNA 轉譯起始的關鍵，當其供應不足時，絕大多數 mRNA 的轉譯都會受到抑制，導致整體蛋白質合成效率顯著下降。
5. 選擇性轉譯： 然而，ISR 卻能選擇性地促進某些 mRNA 的轉譯。其中最著名的是 ATF4 (Activating Transcription Factor 4) 的轉譯。ATF4 的 mRNA 具有一個特殊的 5' 非編碼區 (5' UTR)，其中包含一個小的開放閱讀框 (small upstream open reading frame, uORF)。在正常情況下，PERK 未活化時，核糖體會掃描到 uORF 並進行短暫的轉譯，然後繼續掃描尋找 ATF4 的主要編碼區。

此題考驗學生對基因突變、遺傳密碼的簡併性 (degeneracy of the genetic code) 以及蛋白質功能調控的理解。

Point mutation (點突變) 是指 DNA 序列中單個鹼基的替換、插入或刪除。當點突變發生在開放閱讀框 (Open Reading Frame, ORF) 中時，它可能會改變轉譯產生的蛋白質序列。然而，在某些情況下，這種突變可能不會影響最終蛋白質的功用。

以下是發生在 ORF 中的點突變不會影響最終蛋白質功用的狀況：

1. 同義突變 (Synonymous Mutation) / 沉默突變 (Silent Mutation)：

   • 狀況： 點突變改變了一個密碼子 (codon)，但新的密碼子編碼的是相同的胺基酸。
   • 原因： 這是由於遺傳密碼的簡併性 (degeneracy)。一種胺基酸可能由一個以上的密碼子編碼。例如，亮氨酸 (Leucine) 可以由 6 個不同的密碼子編碼。如果突變將一個編碼某胺基酸的密碼子，變成另一個也編碼相同胺基酸的密碼子，那麼轉譯出的蛋白質序列就不會改變。
   • 影響： 蛋白質的胺基酸序列不變，因此其結構和功能通常也不會受到影響。

2. 改變密碼子，但編碼的胺基酸性質相似 (Conservative Substitution)：

   • 狀況： 點突變改變了一個密碼子，編碼了一個不同但性質相似的胺基酸。
   • 原因： 胺基酸可以根據其物理化學性質（如極性、電荷、大小、疏水性）進行分類。例如，帶有相似側鏈的胺基酸（如帶正電荷的離氨酸 Lys 和精氨酸 Arg，或疏水的丙氨酸 Ala 和纈氨酸 Val）之間的替換，可能不會對蛋白質的整體三級結構和功能產生顯著影響。
   • 影響： 蛋白質的結構可能發生微小變化，但其活性和功能可能保持相對穩定。這種突變稱為「保守性取代」(conservative substitution)。

此題為單選題，考驗學生對原核生物基因調控基本概念的理解，包括操縱子 (operon)、啟動子 (promoter)、阻遏蛋白 (repressor)、誘導物 (inducer) 和輔阻遏物 (corepressor) 的定義。

題目解析：

(i) A sequence of DNA containing a cluster of genes under the control of a single promoter
這描述了一個由單一啟動子控制的一組基因。在原核生物中，這種結構稱為操縱子 (operon)。

• 對應選項：(D) Operon

(ii) A protein that binds to the operator and blocks RNA polymerase
這描述了一種蛋白質，它結合到操縱子的操縱區 (operator)，從而阻止 RNA 聚合酶結合或移動，進而抑制轉錄。這種蛋白質稱為阻遏蛋白 (repressor)。

• 對應選項：(C) Repressor

(iii) A small molecule that binds to a repressor and makes it active

此題考驗學生對組蛋白修飾 (histone modification) 的定義及其與基因表達調控之間關係的理解。

Histone Modification (組蛋白修飾)：

組蛋白修飾是指在組蛋白的 N 端尾巴 (N-terminal tails) 或其他區域發生的共價化學修飾。這些修飾包括乙醯化 (acetylation)、甲基化 (methylation)、磷酸化 (phosphorylation)、泛素化 (ubiquitination) 等。這些修飾會改變組蛋白的電荷、結構以及與 DNA 和其他蛋白質的相互作用。

Correlations between Histone Modification and Gene Expression (組蛋白修飾與基因表達的關聯)：

組蛋白修飾是表觀遺傳調控 (epigenetic regulation) 的重要組成部分，它在決定基因的可及性 (accessibility) 方面起著關鍵作用，進而影響基因的表達。總體而言，組蛋白修飾可以分為兩種主要模式：

1. 活化基因表達 (Activation of Gene Expression)：

   • 標記： 通常與乙醯化 (acetylation) 相關。
   • 機制： 組蛋白乙醯化是指在組蛋白尾巴上的賴氨酸 (lysine) 殘基上添加乙醯基。乙醯化會中和賴氨酸上的正電荷，從而減弱組蛋白與帶負電荷的 DNA 之間的靜電吸引力。這會導致染色質結構變得更鬆散 (euchromatin)，使得 DNA 對轉錄因子和 RNA 聚合酶等轉錄機器的可及性增加。
   • 招募蛋白質： 乙醯化的組蛋白尾巴還可以作為「結合位點」，招募含有溴結構域 (bromodomain) 的蛋白質。這些蛋白質通常是染色質重塑複合物 (chromatin remodeling complexes) 或轉錄輔助因子 (transcriptional coactivators) 的一部分，它們進一步促進轉錄的啟動。
   • 其他修飾： 某些位點的甲基化（如 H3K4me3, H3K4me2, H3K36me3）也與基因活化相關。磷酸化和泛素化也可以在特定情況下參與基因活化。

2. 抑制基因表達 (Repression of Gene Expression)：

   • 標記： 通常與去乙醯化 (deacetylation) 和某些位點的甲基化 (methylation) 相關。
   • 機制：
     • 去乙醯化： 組蛋白去乙醯化是指移除組蛋白尾巴上的乙醯基。這會恢復賴氨酸上的正電荷，增強組蛋白與 DNA 的結合，導致染色質結構變得更緊密 (heterochromatin)。這種緊密的結構阻礙了轉錄機器的進入，從而抑制基因轉錄。
     • 甲基化： 某些位點的甲基化（如 H3K9me2/3, H3K27me3）則直接被認為是抑制基因表達的標記。這些甲基化標記可以被特定的蛋白質（如含有 chromodomain 的蛋白質）識別，這些蛋白質通常是染色質重塑複合物或轉錄抑制因子 (transcriptional repressors) 的一部分，它們進一步壓縮染色質結構。
   • 招募蛋白質： 去乙醯化和抑制性甲基化會招募含有 HP1 (heterochromatin protein 1) 等結構域的蛋白質，這些蛋白質有助於形成高度壓縮的異染色質。

核心觀念

本題考查轉錄因子是否在哺乳動物細胞內與特定啟動子區域結合，最直接且具生理意義的方法是 染色質免疫沉澱法（chromatin immunoprecipitation, ChIP），再搭配定量 PCR（ChIP-qPCR）分析該啟動子是否被富集。

ChIP 的核心原理如下：

1. 轉錄因子若與目標啟動子 DNA 結合，會形成蛋白質—DNA 複合體。
2. 以甲醛固定蛋白質與 DNA 的相互作用。
3. 將染色質打斷成小片段。
4. 使用專一性抗體沉澱目標轉錄因子及其所攜帶的 DNA。
5. 純化沉澱所得 DNA，利用跨越目標啟動子區域的引子進行 qPCR。
6. 若目標啟動子相較於陰性對照有顯著 DNA 富集，即支持該轉錄因子在細胞內與此啟動子結合。

此方法測量的是「細胞內染色質環境中的結合」，比單純的體外 DNA 結合試驗更能反映生理狀態。

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解題方法與實驗設計

一、準備適當的哺乳動物細胞

選用會表現該轉錄因子的哺乳動物細胞，並確認目標基因及其啟動子在此細胞中具有適當表現狀態。

可先進行：

• RT-qPCR：確認目標基因的 mRNA 表現。
• Western blot：確認轉錄因子蛋白質存在。
• 免疫螢光或細胞分餾：確認轉錄因子位於細胞核中。

若內生性轉錄因子的抗體品質不足，可建立表現帶有 FLAG、HA 或 Myc 標籤的轉錄因子細胞株，再使用抗標籤抗體進行 ChIP。但過度表現可能改變轉錄因子濃度與結合位置，因此應搭配接近生理表現量的表現系統。

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二、固定蛋白質與 DNA 的相互作用

以低濃度甲醛處理活細胞，使轉錄因子與其結合的 DNA 片段交聯固定。固定時間不可過長，否則會造成：

• 染色質過度交聯，降低抗體可及性。
• DNA 回收效率下降。
• ChIP 訊號減弱。

固定後加入 glycine 終止交聯反應，接著裂解細胞並取得染色質。

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三、將染色質剪切成適當大小

利用超音波震盪（sonication）或核酸酶消化，將染色質剪切成約 $200$–$1000$ bp 的片段，常用目標大小約為 $200$–$500$ bp。

片段太大會使 qPCR 訊號無法精確定位於啟動子；片段太小則可能造成 DNA 回收量降低。應取樣進行凝膠電泳或使用片段分析儀確認剪切品質。

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四、以專一性抗體進行染色質免疫沉澱

將剪切後的染色質分成數組，分別加入：

1. 目標轉錄因子抗體
   用來沉澱含有目標轉錄因子的染色質片段。

2. 正常 IgG 對照
   檢測非特異性抗體與 Protein A/G beads 所造成的背景沉澱。

3. Input 對照
   在免疫沉澱前保留一部分總染色質，代表原始樣本中各 DNA 片段的比例。

抗體需具備 ChIP 驗證資料，且最好使用不同抗體重複實驗，以降低抗體非特異性造成的誤判。

免疫沉澱後以 Protein A/G beads 捕捉抗體—蛋白質—DNA 複合體，經多次洗滌去除非特異性結合，最後將交聯逆轉並純化 DNA。

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五、設計 qPCR 引子分析目標啟動子

在目標基因啟動子中設計一組 qPCR 引子，使擴增片段涵蓋：

• 預測的轉錄因子結合位點。
• 轉錄起始點附近區域。
• 啟動子核心區域。

同時應設計下列區域作為比較：

• 近端陰性區域：位於啟動子外、預期不會被該轉錄因子結合的位置。
• 基因組陰性區域：遠離目標啟動子的區域，且不含預測結合位點。
• 已知陽性區域：若該轉錄因子已有已知靶基因，可作為 ChIP 的陽性控制。

qPCR 引子應具有良好效率，擴增片段通常控制在約 $70$–$150$ bp，並以熔解曲線或電泳確認單一產物。

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結果分析

一、Input 正規化

先將各樣本的 Ct 值相對於 Input 進行校正。若 Input 僅取總染色質的一小部分，需依稀釋倍數校正。

常用計算方式為：

核心觀念

本題考查 miRNA（microRNA）如何透過 RNA-induced silencing complex（RISC）抑制基因表現，重點包括：

1. miRNA 的生成與成熟。
2. miRNA 裝載至 Argonaute（Ago）蛋白形成 miRISC。
3. miRNA 依序列互補性辨認目標 mRNA。
4. 透過抑制轉譯或促進 mRNA 降解，降低蛋白質產量。

成熟 miRNA 通常約 $21$–$23$ 個核苷酸，主要與目標 mRNA 的 $3'$ 非轉譯區（$3'$ UTR）配對。

解題方法

可依「生成 → 尋找目標 → 抑制表現」三個階段作答。

一、miRNA 的生成與成熟

miRNA 基因通常由 RNA polymerase II 轉錄，先形成具有髮夾結構的初級 miRNA（pri-miRNA）。在細胞核中，Drosha 與 DGCR8 組成的微加工複合體將 pri-miRNA 切割成約 $70$ 個核苷酸的前驅 miRNA（pre-miRNA）。

pre-miRNA 經 Exportin-5 輸送至細胞質後，由 Dicer 切割成約 $21$–$23$ 個核苷酸的雙股 miRNA。接著其中一股作為引導股（guide strand），裝載至 Argonaute 蛋白；另一股通常被移除，形成 miRNA-induced silencing complex（miRISC）。

二、辨認目標 mRNA

miRISC 中的 miRNA 以其種子區（seed region，通常為第 $2$–$8$ 個核苷酸）與目標 mRNA 的互補序列配對。動物 miRNA 多半與 $3'$ UTR 進行不完全互補配對，因此一個 miRNA 可以調控多種 mRNA；同一個 mRNA 也可受到多種 miRNA 調控。

三、抑制基因表現

miRNA 與目標 mRNA 結合後，主要透過下列方式降低基因表現：

1. 抑制轉譯