108 年 國立成功大學微生物及免疫學研究所丙組《分子生物學》

本題主要考察學生對於 DNA 雙螺旋結構、不同形式的 DNA，以及 DNA、RNA 和蛋白質合成所需的基本組成單元、酵素與反應過程的理解。

1. a. DNA 雙螺旋結構、形式與特性

DNA 雙螺旋基本結構：
DNA 雙螺旋是由兩條反向平行（antiparallel）的核苷酸鏈組成，這兩條鏈透過鹼基對之間的氫鍵連結。

• 五碳糖 (Deoxyribose Sugar)： 每個核苷酸的核心是脫氧核糖，這是一種五碳糖。其 3' 碳原子和 5' 碳原子分別與相鄰的核苷酸形成磷酸二酯鍵。
• 含氮基 (Nitrogenous Base)： 鹼基連接在五碳糖的 1' 碳原子上。DNA 中有四種含氮基：腺嘌呤 (Adenine, A)、鳥糞嘌呤 (Guanine, G) 屬於嘌呤 (Purine) 類（雙環結構）；胞嘧啶 (Cytosine, C) 和胸腺嘧啶 (Thymine, T) 屬於嘧啶 (Pyrimidine) 類（單環結構）。
• 磷酸鹽 (Phosphate Group)： 磷酸基團連接在五碳糖的 5' 碳原子上，並與另一個核苷酸的 3' 碳原子上的羥基形成磷酸二酯鍵，構成 DNA 鏈的骨架。

結構示意圖：
（請自行繪製，需包含五碳糖的 1', 3', 5' 碳原子標示，鹼基連接在 1' 碳，磷酸基連接在 5' 碳，磷酸二酯鍵連接 5' 碳與下一個核苷酸的 3' 碳。兩條鏈反向平行，鹼基對 A-T (雙氫鍵) 和 G-C (三氫鍵) 互補配對。）

DNA 雙螺旋的形式：
DNA 雙螺旋主要有三種形式：A-DNA, B-DNA, 和 Z-DNA。

• B-DNA： 是生理條件下最常見的 DNA 形式，也是 Watson-Crick 模型所描述的結構。它呈右手螺旋，直徑約 2 nm，每個螺旋週期約 10.5 個鹼基對，長度約 3.4 nm。溝槽（groove）有大溝（major groove）和小溝（minor groove）。
• A-DNA： 在較低的水分活度下形成，也是右手螺旋，但結構更緊密。直徑約 2.6 nm，每個螺旋週期約 11 個鹼基對，較寬且扁平。
• Z-DNA： 呈左手螺旋，結構細長且扭曲，像「Z」字形。它在 GC-rich 的序列或特定蛋白質結合時可能出現。鹼基對排列方式與 B-DNA 不同，溝槽也不同。

特性：

• 互補配對 (Complementary Base Pairing)： 嘌呤與嘧啶之間以氫鍵配對，A 總是與 T 配對（2 個氫鍵），G 總是與 C 配對（3 個氫鍵）。這是 DNA 複製和轉錄的基礎。
• 反向平行 (Antiparallel)： 兩條核苷酸鏈的方向相反，一條從 5' 端到 3' 端，另一條從 3' 端到 5' 端。
• 螺旋結構 (Helical Structure)： 雙螺旋結構提供了穩定性，並保護了鹼基對免受化學損傷。
• 大溝與小溝 (Major and Minor Grooves)： 這些溝槽是蛋白質（如轉錄因子）與 DNA 結合的位點，因為溝槽暴露了鹼基對的特定化學訊息。

1. b. 合成 DNA、RNA 及蛋白質所需的材料、酵素與反應過程

合成 DNA (DNA Replication)：

• 材料 (Monomers)： 四種去氧核糖核苷三磷酸 (Deoxyribonucleoside triphosphates, dNTPs)：dATP, dGTP, dCTP, dTTP。
• 酵素 (Enzymes)：

本題主要考察學生對 DNA 半保留複製概念的理解，以及 DNA 複製過程中校對機制的知識。

2. a. Semiconservative DNA replication (半保留複製)

定義：
Semiconservative DNA replication 指的是在 DNA 複製過程中，每一條親代 DNA 雙螺旋鏈都作為模板，合成一條新的互補鏈。因此，複製完成後產生的兩個 DNA 分子，每個分子都包含一條來自親代 DNA 的舊鏈和一條新合成的鏈。

原理：
這個模型由 Watson 和 Crick 在提出 DNA 雙螺旋結構後提出。他們認為，由於鹼基配對的專一性（A-T, G-C），兩條親代 DNA 鏈可以被分開，然後各自作為模板，引導新核苷酸的聚合，形成與之互補的新鏈。這樣，每個子代 DNA 分子都能精確地繼承親代 DNA 的一半遺傳訊息。

實驗證據：
Meselson 和 Stahl 的實驗是證明 DNA 半保留複製的經典實驗。他們利用同位素標記（$^{15}$N）的 DNA，在含有正常$^{14}$N 的培養基中進行大腸桿菌的 DNA 複製。通過密度梯度離心分析，他們觀察到：

• 第一代複製後，所有 DNA 分子都含有一個$^{15}$N 標記的鏈和一個$^{14}$N 的新鏈，密度介於純$^{15}$N DNA 和純$^{14}$N DNA 之間。
• 第二代複製後，DNA 分子密度分為兩類：一半是單鏈$^{15}$N 和單鏈$^{14}$N 的雜合分子，另一半是純$^{14}$N 的分子。
  這結果完美支持了半保留複製模型，而非全保留（一個子代全舊，另一個全新）或分散（新舊鏈隨機混合）模型。

2. b. DNA 複製過程中的 Proofreading 機制

生物為了維持遺傳訊息的準確性，DNA 複製過程中存在多種校對（Proofreading）機制，以盡量減少複製錯誤。最主要的校對機制是 DNA 聚合酶自身的 3'→5' 外切酶活性（exonuclease activity）。

主要校對機制：

本題旨在考察學生對基因表現調控的多層次機制的理解，特別是從 mRNA 層級到蛋白質層級的調控。題目描述了兩種不同的基因表現模式，需要解釋其背後可能的調控機制。

核心觀念： 基因表現調控可以發生在多個層級，包括轉錄、轉譯後修飾、蛋白質降解、mRNA 的穩定性、翻譯效率等。

分析題目描述：

• 基因 X： mRNA 和蛋白質表現量均明顯增加。這表示調控主要發生在 mRNA 的生成（轉錄）或穩定性，進而導致蛋白質增加。
• 基因 Y： 只有蛋白質表現量增加，mRNA 量沒有明顯變化。這表示調控主要發生在轉譯階段，或是蛋白質的穩定性增加，而非 mRNA 的生成。

詳細解釋可能調節機制：

對於基因 X (mRNA 和蛋白質均增加)：

這種情況表明，從基因到 mRNA 的過程（轉錄）或 mRNA 的穩定性，受到了正向調控，導致 mRNA 數量增加，進而翻譯出更多的蛋白質。可能的機制包括：

1. 轉錄增強 (Transcriptional Activation)：

   • 機制： 啟動子 (promoter) 或增強子 (enhancer) 區域的調控因子（轉錄因子）結合，促進 RNA 聚合酶與啟動子結合，增加轉錄速率。
   • 可能原因： 細胞接收到某種訊號，啟動了特定的轉錄因子，這些轉錄因子結合到基因 X 的調控區域，激活了轉錄。

2. mRNA 穩定性增加 (Increased mRNA Stability)：

   • 機制： 轉錄產生的 mRNA 分子可能受到某種因素影響，使其降解速率減慢，從而延長了其在細胞內的壽命，積累了更多的 mRNA 分子，可供翻譯。
   • 可能原因： 結合到 mRNA 上的 RNA 結合蛋白 (RNA-binding proteins) 能夠保護 mRNA 免受核酸酶的降解，或者特定的 RNA 結構（如 Poly(A) 尾巴的長度）影響了其穩定性。

3. mRNA 轉運效率增加 (Increased mRNA Transport Efficiency)：

   • 機制： 如果 gene X 的 mRNA 在細胞核內合成後，其被運送到細胞質的效率增加，也能導致細胞質中可供翻譯的 mRNA 總量增加。

對於基因 Y (只有蛋白質增加，mRNA 量不變)：

本題為名詞解釋題，要求學生對分子生物學領域中幾個重要概念進行準確定義和簡要說明。

4. 名詞解釋

a. Cre/lox recombination system

• 定義： Cre/lox 重組系統是一種基於酶-DNA 相互作用的遺傳學工具，廣泛應用於研究基因功能。它包含兩個主要組分：
  • Cre 重組酶 (Cre recombinase)： 一種源自噬菌體的酵素，屬於 type I 的 DNA 重組酶。
  • loxP 位點 (locus of X-over P1)： 一段 34 bp 的 DNA 序列，由一個 13 bp 的反向重複序列（palindrome）和中間一個 8 bp 的非重複序列組成。
• 作用機制： Cre 重組酶能夠識別並結合到 loxP 位點上。當兩個 loxP 位點出現在同一條 DNA 分子上時，Cre 重組酶會催化這兩個位點之間的 DNA 重組。
  • 如果兩個 loxP 位點是順向排列，重組會導致中間的 DNA 片段發生倒位 (inversion)。
  • 如果兩個 loxP 位點是反向排列，重組會導致中間的 DNA 片段被切除 (excision)，形成一個環狀 DNA 分子，並將剩餘的 DNA 連接起來。
• 應用： 這種系統在基因敲除 (gene knockout)、基因標記、基因標籤、誘導性基因表達調控等方面具有重要應用，尤其是在建立轉基因動物模型時，可用於精確地刪除或改變特定基因。

b. Long non-coding RNA (lncRNA)

• 定義： Long non-coding RNA (lncRNA) 是指長度大於 200 個核苷酸，但不能被轉譯成蛋白質的 RNA 分子。它們過去常被認為是基因組的「垃圾 DNA」的轉錄產物，但現在已知 lncRNA 在基因表現調控中扮演著多樣且重要的角色。
• 功能： lncRNA 的功能非常廣泛，可以通過多種機制調控基因表現：
  • 表觀遺傳調控： 作為支架分子，招募組蛋白修飾酶或 DNA 甲基轉移酶到特定的基因位點，影響染色質結構和基因表達（例如 X 染色體失活中的 Xist lncRNA）。
  • 轉錄調控： 可以與轉錄因子或 RNA 聚合酶結合，促進或抑制基因的轉錄。
  • 轉譯調控： 可以與 mRNA 結合，影響其穩定性、剪接或翻譯效率。
  • 細胞質調控： 在細胞質中，lncRNA 可以通過模擬 microRNA 的作用（海綿效應，sponging miRNAs）或與蛋白質複合體相互作用來調控基因表現。
• 重要性： lncRNA 的發現擴展了我們對基因表現調控的理解，並在許多疾病（如癌症）的發生發展中發揮作用。

c. CRISPR/Cas9

• 定義： CRISPR/Cas9 系統是一種強大且精確的基因編輯技術，源自細菌的適應性免疫系統。它利用一個 Cas9 內切酶和一個引導 RNA (guide RNA, gRNA) 來實現對特定 DNA 序列的切割。
  • Cas9 蛋白質： 一種核酸酶，能夠切割雙鏈 DNA。
  • 引導 RNA (gRNA)： 由兩部分組成：

本題考察學生對於研究蛋白質-蛋白質交互作用 (Protein-Protein Interaction, PPI) 的常用實驗方法的知識，要求能列舉兩種方法並解釋其原理。

核心觀念： 蛋白質之間的交互作用是細胞內許多生命活動（如信號傳導、代謝、細胞結構維持）的基礎。在後基因體時代，大規模鑑定和研究 PPIs 成為熱點。

兩種常用的 PPI 研究方法及其原理：

1. 酵母雙雜交 (Yeast Two-Hybrid, Y2H) 系統

• 原理： Y2H 系統是一種基於轉錄激活的體內 (in vivo) 方法，用於篩選和鑑定兩個蛋白質之間的直接結合。它利用了細菌轉錄因子 GAL4 的結構特點，該因子包含一個 DNA 結合域 (DNA-binding domain, DBD) 和一個激活域 (activation domain, AD)。
  • 實驗設計：
    1. 將已知蛋白質 X 的 cDNA 插入到一個載體中，使其與 GAL4 的 DBD 融合，形成一個「誘餌」蛋白（Bait protein）。
    2. 將待測未知蛋白質 Y 的 cDNA 隨機插入到另一個載體中，使其與 GAL4 的 AD 融合，形成一個「獵物」蛋白（Prey protein）。
    3. 將這兩種載體同時轉入酵母細胞。
  • 工作機制：
    • 如果蛋白質 X 和蛋白質 Y 之間不結合，那麼 GAL4 的 DBD 和 AD 就無法被帶到同一個啟動子區域，轉錄激活就不會發生，報告基因（如 HIS3, lacZ）就不會表達。
    • 如果蛋白質 X 和蛋白質 Y 之間直接結合，它們會形成一個複合物，將 GAL4 的 DBD 和 AD 帶到報告基因的啟動子區域。DBD 結合到啟動子上的特定 DNA 序列，而 AD 招募 RNA 聚合酶 II，從而激活報告基因的轉錄。
  • 結果判讀： 報告基因的表達（例如酵母能在缺乏組胺酸的培養基上生長，或 lacZ 產生藍色色素）表明蛋白質 X 和 Y 之間存在直接的交互作用。
• 優點： 能夠在細胞內篩選大量潛在的 PPIs，適用於大規模篩選。
• 缺點： 存在假陽性和假陰性的可能；篩選的 PPIs 必須是直接結合；部分蛋白質可能無法在酵母細胞中正確摺疊或維持活性。

2. 免疫沉澱 (Immunoprecipitation, IP) / 染色質免疫沉澱 (Chromatin Immunoprecipitation, ChIP) 及質譜分析 (Mass Spectrometry, MS)

• 原理： 這是一種體外 (in vitro) 或體內 (in vivo) 的方法，用於鑑定與特定蛋白質結合的蛋白質複合物。IP 的基本原理是利用抗體與目標蛋白質結合，然後將這個蛋白質-抗體複合物從溶液中沉澱下來，再通過其他方法（如質譜分析）鑑定與目標蛋白質共沉澱的其他蛋白質。