109 年 國立成功大學微生物及免疫學研究所丙組《分子生物學》

此題主要考查 CRISPR/Cas9 系統的原理與應用。CRISPR/Cas9 是一種源自細菌的適應性免疫系統，經科學家改造後，已成為強大的基因編輯工具。

CRISPR/Cas9 系統原理：

1. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)：這是細菌基因組中的一段 DNA 序列，由重複序列 (repeats) 和插入序列 (spacers) 交替組成。重複序列是短的、回文的 DNA 片段，而插入序列是過去感染過的噬菌體或質體的 DNA 片段。
2. Cas9 (CRISPR-associated protein 9)：這是一種 DNA 酶，能夠切割雙股 DNA。在細菌的免疫系統中，Cas9 蛋白與一段稱為 guía RNA (gRNA) 的 RNA 分子結合。
3. gRNA (guía RNA)：這是由 CRISPR 陣列中的插入序列轉錄而來，包含兩部分：
   • crRNA (CRISPR RNA)：負責識別並結合目標 DNA 序列。
   • tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)：與 crRNA 結合，並幫助引導 Cas9 蛋白。在基因工程應用中，crRNA 和 tracrRNA 常被設計成一個單一的嵌合體分子，稱為單鏈 guía RNA (sgRNA)。
4. 作用機制：
   • 當細菌再次感染與插入序列相符的噬菌體時，gRNA 會結合到 Cas9 蛋白上。
   • gRNA 的 crRNA 部分會識別並結合到噬菌體 DNA 上與之互補的序列。
   • Cas9 蛋白在 gRNA 的引導下，會在目標 DNA 序列的特定位置（通常在 PAM 序列附近）切割雙股 DNA，從而破壞噬菌體 DNA，保護細菌。

此題考查細菌基因調控的經典案例：大腸桿菌的乳糖操縱組 (lactose operon)。

乳糖操縱組 (Lactose Operon) 的作用機制：

乳糖操縱組是原核生物中一種典型的基因調控單元，用於調控大腸桿菌利用乳糖作為碳源的能力。它包含幾個關鍵組件：

1. 啟動子 (Promoter, P)：RNA 聚合酶結合並開始轉錄的區域。
2. 操縱區 (Operator, O)：一個位於啟動子下游的 DNA 序列，阻遏蛋白 (repressor) 會結合於此，以阻止 RNA 聚合酶接近啟動子，從而抑制轉錄。
3. 結構基因 (Structural Genes)：編碼參與乳糖代謝的蛋白質的基因。這些基因通常是連續排列並一起被轉錄成一個多順操子 (polycistronic mRNA)。
4. 調控基因 (Regulatory Gene)：一個獨立的基因，編碼一個阻遏蛋白，它能夠與操縱區結合。這個調控基因通常位於操縱組的啟動子和操縱區之外，並具有自己的啟動子。

作用機制詳述：

乳糖操縱組受到兩種主要調控因子的影響：阻遏蛋白 (repressor) 和活化蛋白 (activator protein, CAP)。

• 在沒有乳糖存在時：

  • 調控基因 (lacI) 持續轉錄並翻譯，產生乳糖操縱組阻遏蛋白 (LacI protein)。
  • LacI 蛋白具有與操縱區 (O) 結合的能力，它會結合到操縱區上。
  • 當 LacI 蛋白結合到操縱區時，它會阻礙 RNA 聚合酶靠近啟動子 (P)，因此乳糖代謝相關的結構基因無法被轉錄。操縱組處於「關閉」狀態。

• 在有乳糖存在時：

  • 乳糖 (lactose) 或其異構物（如烯乳糖 allolactose）會作為誘導物 (inducer)。
  • 誘導物會與 LacI 阻遏蛋白結合，改變其構象，使其無法再結合到操縱區。
  • 一旦阻遏蛋白從操縱區解離，RNA 聚合酶就能夠結合到啟動子 (P) 上，並開始轉錄結構基因，產生乳糖操縱組的 mRNA。
  • 這個 mRNA 被翻譯成參與乳糖代謝的蛋白質。

此題考查噬菌體 (bacteriophage) 的生活史及其與宿主細胞的相互作用，特別是潛溶性感染 (lysogenic infection) 的機制。

噬菌體的生活史兩類 (4%)：

噬菌體的生活史主要分為兩種類型：

1. 溶解性生活史 (Lytic Cycle)：

   • 噬菌體感染宿主細胞後，會迅速複製其基因組，合成噬菌體組件，組裝成新的噬菌體顆粒。
   • 最終，噬菌體會誘導宿主細胞裂解 (lysis)，釋放出大量新的噬菌體顆粒，這些顆粒再去感染其他細菌。
   • 此過程會導致宿主細胞死亡。

2. 潛溶性生活史 (Lysogenic Cycle)：

   • 噬菌體感染宿主細胞後，其基因組不會立即複製和組裝成新的噬菌體。
   • 相反，噬菌體 DNA 會整合到宿主細菌的染色體中，成為一個稱為 前噬菌體 (prophage) 的結構。
   • 前噬菌體會隨著細菌的複製而傳承給下一代。
   • 在特定條件下（如宿主細胞受損、壓力等），前噬菌體可以從宿主染色體中切離，進入溶解性生活史，開始複製和產生新的噬菌體。
   • 在潛溶性階段，噬菌體通常會抑制進一步的噬菌體複製，這也可能賦予宿主一些新的特性。

噬菌體 DNA 插入宿主細胞的作用機制與參與的酵素 (16%)：

當噬菌體選擇潛溶性生活史時，其 DNA 會插入宿主細菌的染色體。這個過程涉及以下機制和酵素：

1. 識別與結合：噬菌體首先通過其尾部結構識別並吸附到宿主細胞表面的特定受體上。然後將其核酸（通常是 DNA）注入細胞。
2. 整合：
   • 整合位點 (Integration Site)：噬菌體 DNA 中有一個特定的區域（整合序列，attP），而細菌染色體上也有一個對應的區域（整合序列，attB）。這兩個序列具有一定的同源性。

此題考查 B 細胞產生抗體多樣性的分子機制，核心是免疫球蛋白基因的體細胞重組 (somatic recombination)。

B 細胞活化與抗體多樣性的產生機制：

B 細胞在成熟過程中，會通過一種稱為 體細胞基因重組 (somatic V(D)J recombination) 的機制，在胚胎時期就開始產生大量的抗體多樣性。這個過程是 B 細胞特有的，發生在骨髓中 B 細胞發育的早期階段。抗體（免疫球蛋白）是由重鏈 (heavy chain) 和輕鏈 (light chain) 組成的蛋白質。兩種鏈的變異區 (variable region) 決定了抗體的抗原結合特異性。

抗體多樣性產生的三大機制：

1. 基因片段的多樣性 (V(D)J Recombination)：

   • 基因結構：編碼抗體變異區的基因座 (gene loci) 並非連續的單一基因，而是由多個不同的基因片段組成。
     • 重鏈基因座：包含 V (Variable, 變異區)、D (Diversity, 多樣性區) 和 J (Joining, 連接區) 三種不同類型的基因片段。
     • 輕鏈基因座：包含 V (變異區) 和 J (連接區) 兩種基因片段（沒有 D 區）。B 細胞只有一種輕鏈，kappa ($\kappa$) 或 lambda ($\lambda$)，兩者結構類似但分別由不同基因座編碼。
   • 重組過程：
     • D-J 重組 (僅重鏈)：首先，DNA 上的 D 基因片段和 J 基因片段隨機選擇並連接在一起。這個過程中會隨機刪除中間的 DNA 序列。
     • V-DJ 重組 (僅重鏈)：然後，一個 V 基因片段隨機選擇並連接到已連接好的 DJ 組合上。
     • V-J 重組 (輕鏈)：對於輕鏈，一個 V 基因片段隨機選擇並連接到一個 J 基因片段上。
   • 多樣性：由於有數十到上百個 V、D、J 片段可供選擇，它們的隨機組合產生了極大的變異性。例如，若有 50 個 V、6 個 D、20 個 J 片段，僅 VDJ 組合就能產生 $50 \times 6 \times 20 = 6000$ 種重鏈變異區。

2. 節點多樣性 (Junctional Diversity)：

   • 在 V(D)J 重組過程中，當兩個基因片段（如 V 和 DJ，或 V 和 J）連接時，其連接點（節點）的序列會發生隨機的插入和刪除。
   • RSS (Recombination Signal Sequences)：在每個 V、D、J 基因片段的末端都緊鄰著一個稱為重組信號序列 (RSS) 的 DNA 模體。RSS 包含一個 7 鹼基的保守序列 (7-mer) 和一個 9 鹼基的保守序列 (9-mer)，中間間隔 12 或 23 個鹼基的變異序列。

此題考查五個重要的分子生物學名詞。

(1) Apoptosis (凋亡)

• 意義/功能：凋亡（Apoptosis），又稱程式性細胞死亡 (Programmed Cell Death, PCD)，是一種主動的、受基因調控的細胞死亡過程。它與壞死 (necrosis) 不同，壞死是細胞受到外傷或毒素損害後無序的死亡。
• 重要性：
  • 發育過程：在多細胞生物的胚胎發育過程中，凋亡對於形態發生至關重要，例如手指和腳趾的形成（去除指間的細胞）、神經系統的發育（清除未使用的神經元）等。
  • 組織穩態：維持組織的正常結構和功能，清除衰老、受損或異常的細胞，防止其對機體造成危害。
  • 免疫系統：清除受感染的細胞，清除自身免疫細胞，防止自身免疫疾病。
  • 腫瘤抑制：清除潛在的癌前細胞，防止腫瘤的形成。
• 機制：凋亡的過程是高度有序的，涉及一系列細胞內事件，包括：細胞體積收縮、染色質濃縮、DNA 片段化、細胞膜起泡 (blebbing)，最終形成凋亡小體 (apoptotic bodies)，被吞噬細胞清除，而不引起炎症反應。凋亡的啟動可以通過內源性途徑（如細胞受損、DNA 損傷）或外源性途徑（如細胞表面死亡受體結合配體）進行，最終激活細胞內的凋亡執行蛋白（如 Caspases）。

(2) Autophagy (自噬)

• 意義/功能：自噬（Autophagy）是細胞內一種基本的分解代謝途徑，細胞通過該途徑將細胞質內的成分（如受損的細胞器、蛋白質聚集體、入侵的病原體）包裹在雙層膜結構的自噬體 (autophagosome) 中，然後自噬體與溶酶體 (lysosome) 融合，將這些物質降解並回收利用。
• 重要性：
  • 細胞穩態：清除細胞內不需要或有害的成分，維持細胞器的健康和細胞質的穩態。
  • 營養供給：在營養匱乏時，自噬可以分解細胞內成分提供能量和基本分子，幫助細胞度過飢餓狀態。
  • 抗病性：清除入侵的細菌、病毒等病原體。
  • 抗衰老：與細胞衰老和壽命延長有關。
  • 疾病相關：自噬功能異常與許多疾病有關，包括神經退行性疾病（如阿茲海默症、帕金森症）、癌症、感染性疾病和代謝性疾病。

(3) Shine-Dalgarno sequence (沙因-達爾加諾序列)

• 意義/功能：沙因-達爾加諾序列（Shine-Dalgarno sequence, SD sequence）是原核生物 mRNA 上的一個核糖體結合位點，位於起始密碼子 (AUG) 上游約 6-12 個核苷酸的位置。
• 功能：它是一個富含嘌呤的序列（通常是 AGGAGG），能夠與 16S 核糖體 RNA (rRNA) 的 3' 端反鹼基互補配對。這種配對將核糖體準確地定位在 mRNA 的起始密碼子上，從而確保蛋白質合成的起始準確。
• 重要性：在原核生物中，mRNA 的翻譯起始依賴於 SD 序列與 16S rRNA 的結合，這是核糖體準確識別並結合到 mRNA 上的關鍵步驟。

(4) Non-coding RNA (非編碼 RNA)