108 年 國立成功大學環境工程學系碩士班丙組《微生物學》

本題主要在測試學生對於微生物學中幾個重要基本觀念的理解程度，以及這些觀念之間的相互關聯性。

(a) Nitrification and Nitrospira
Nitrification（硝化作用）是氮循環中的一個重要過程，主要由兩階段組成：氨氧化（ammonia oxidation）和亞硝酸鹽氧化（nitrite oxidation）。

• 氨氧化：將氨（$NH_3$ 或 $NH_4^+$）氧化成亞硝酸鹽（$NO_2^-$）。此過程主要由氨氧化菌（Ammonia-Oxidizing Bacteria, AOB）和氨氧化古菌（Ammonia-Oxidizing Archaea, AOA）完成。
• 亞硝酸鹽氧化：將亞硝酸鹽（$NO_2^-$）氧化成硝酸鹽（$NO_3^-$）。此過程主要由亞硝酸鹽氧化菌（Nitrite-Oxidizing Bacteria, NOB）完成。
  Nitrospira 是一屬重要的亞硝酸鹽氧化菌，在硝化作用的第二階段扮演關鍵角色，負責將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽。因此，Nitrification（硝化作用）是一個生物地球化學過程，而 Nitrospira 則是執行該過程（特別是亞硝酸鹽氧化階段）的關鍵微生物類群之一。兩者關係密切，Nitrospira 是硝化作用不可或缺的執行者。
  【答案】Nitrification 是一個生物地球化學過程，而 Nitrospira 是一種執行硝化作用（將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽）的微生物。

(b) Horizontal gene transfer and Plasmid
Horizontal gene transfer（水平基因轉移，HGT），又稱橫向基因轉移，是指生物體將遺傳物質傳遞給同代或不同代的其他生物體，而非通過垂直遺傳（從親代到子代）。HGT 是微生物演化和適應環境的重要驅動力，可以快速獲得新的基因，例如抗生素抗性基因、毒力因子等。
Plasmid（質體）是細菌、古菌等細胞內染色體外的小型環狀 DNA 分子，能夠獨立複製。質體通常攜帶一些非必需但對宿主有益的基因，例如抗生素抗性基因、代謝特定物質的基因等。
質體是 HGT 的重要載體之一。細菌可以通過接合作用（conjugation）、轉化作用（transformation）或轉導作用（transduction）等機制，將質體及其攜帶的基因傳遞給其他細菌。因此，質體是 HGT 的一種常見且重要的媒介，使得外源基因能夠在微生物群落中迅速擴散。
【答案】Horizontal gene transfer 是一種遺傳物質的傳遞方式，而 Plasmid 是攜帶這些遺傳物質（基因）的常見載體，通過 HGT 可以在微生物之間傳播。

(c) Flagella and Chemotaxis
Flagella（鞭毛）是許多細菌、古菌和真核細胞表面附屬的細長絲狀結構，主要功能是提供細胞運動的能力，使細胞能夠在液體環境中游動。

核心觀念

本題比較兩類水質微生物分析方法：

1. 傳統培養微生物學方法：以大腸桿菌能在選擇性培養基上生長、形成菌落或產生特定代謝反應為依據，測定具有培養活性的細菌數量。
2. 環境分子生物學方法：萃取水樣中的 DNA，利用特定基因標的進行核酸擴增與定量，估算大腸桿菌的基因拷貝數。

兩者測得的生物意義不同：

• 培養法主要反映「能在指定培養條件下形成菌落的活菌」。
• 分子方法主要反映「水樣中含有目標基因的細胞或遺傳物質」，不必然等於仍具有活性的細菌數。

常見單位為：

• 培養法：$\mathrm{CFU/100\,mL}$ 或 $\mathrm{MPN/100\,mL}$
• 分子方法：基因拷貝數／$100\,\mathrm{mL}$，即 $\mathrm{gene\,copies/100\,mL}$

其中，$100\,\mathrm{mL}$ 是水質微生物檢測常用的標準化體積，便於不同水樣與法規標準之間比較。

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解題方法一：傳統培養微生物學方法

方法一：膜過濾法

膜過濾法適合分析相對澄清、細菌濃度不過高的水樣，操作流程如下：

1. 量取固定體積水樣，例如 $100\,\mathrm{mL}$。
2. 以孔徑約 $0.45\,\mu\mathrm{m}$ 的無菌濾膜過濾水樣，使細菌被截留於濾膜表面。
3. 將濾膜貼於大腸桿菌選擇性培養基。
4. 於適當溫度與時間培養。
5. 計數具有大腸桿菌特徵的菌落。
6. 以菌落形態、呈色反應及生化試驗進行確認。

常用培養基包括具大腸桿菌選擇性與鑑別功能的培養基，例如含有特定酵素受質的顯色培養基。大腸桿菌通常可因具有 β-glucuronidase 等酵素而產生特定顏色，但實際結果仍須依培養基規格及確認試驗判定。

濃度計算

若過濾 $100\,\mathrm{mL}$ 水樣後，計得 $37$ 個確認為大腸桿菌的菌落，則：

$$\text{大腸桿菌濃度} = \frac{37\ \mathrm{CFU}}{100\ \mathrm{mL}} = 37\ \mathrm{CFU/100\,mL}$$

若實際只過濾 $10\,\mathrm{mL}$ 水樣，計得 $12$ 個菌落，則換算為：

$$\text{濃度} = 12\times\frac{100}{10} = 120\ \mathrm{CFU/100\,mL}$$

一般而言，應選擇菌落數適中的培養皿計算，避免菌落過密造成重疊，也避免菌落過少導致統計誤差過大。

方法二：多管發酵法與最可能數法

當水樣混濁、懸浮固體含量高，不適合直接膜過濾時，可使用多管發酵法：

1. 將不同體積或不同稀釋倍數的水樣接種至多組培養管。
2. 先以選擇性培養基培養，觀察產酸、產氣或其他陽性反應。
3. 將陽性管轉接至確認培養基。
4. 依各稀釋組的陽性管數，查閱統計表得到 $\mathrm{MPN}$。

例如，依三組不同接種量所得陽性管組合查表，結果為 $MPN=23$，則可表示為：

$$23\ \mathrm{MPN/100\,mL}$$

MPN 並非直接數出細菌個體，而是根據陽性與陰性培養管的機率分布推估水樣中的平均活菌數，因此結果通常以「最可能數」表示。

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解題方法二：環境分子生物學方法

定量聚合酶連鎖反應

環境分子生物學中最具代表性的方式是定量聚合酶連鎖反應，即 qPCR。其基本流程如下：

1. 量取水樣，例如 $100\,\mathrm{mL}$。
2. 以濾膜濃縮微生物。
3. 破壞細胞並萃取總 DNA。
4. 以大腸桿菌特異性引子，擴增目標基因。
5. 透過螢光訊號即時監測擴增反應。
6. 以標準曲線將循環閾值 $C_t$ 換算為 DNA 濃度或基因拷貝數。
7. 校正萃取體積、稀釋倍數與實際水樣體積，換算成每 $100\,\mathrm{mL}$ 的濃度。

目標基因可選擇大腸桿菌特異性標誌基因，例如 uidA、lacZ 或其他經驗證的分類標誌。若研究目標是毒性大腸桿菌，則需檢測毒力基因，例如 stx、eae 等；單純檢測大腸桿菌標誌基因，不能直接證明該菌株具有特定致病性。

qPCR 定量示例

假設：

• 取水樣體積：$100\,\mathrm{mL}$
• DNA 萃取後定容為：$100\,\mu\mathrm{L}$
• qPCR 使用 DNA：$2\,\mu\mathrm{L}$
• 該反應測得：$400$ 個目標基因拷貝
• 未進行其他稀釋

則整管 DNA 萃取液中的基因拷貝數為：

$$400\times\frac{100}{2} = 20{,}000\ \mathrm{gene\ copies}$$

因為這些 DNA 來自原始 $100\,\mathrm{mL}$ 水樣，所以水樣濃度為：

$$20{,}000\ \mathrm{gene\ copies/100\,mL}$$

實際檢測時還需納入 DNA 回收率、抑制物、空白對照、標準曲線效率及稀釋倍數等因素。

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培養法與分子方法的差異

本題分為兩部分，第一部分要求說明如何分離獲得一株能分解甲苯的純菌，第二部分則是如何確認該菌株的純度。

第一部分：分離獲得一株分解甲苯的純菌 (10分)

目標是從含有能分解甲苯的微生物群落中，分離出單一菌株並確保其具有分解甲苯的能力。

• 步驟一：樣品採集與富集 (Sample Collection and Enrichment)

  1. 樣品來源： 尋找可能含有能分解甲苯微生物的環境，例如受污染的土壤、地下水、或長期接觸甲苯的工業廢水。
  2. 富集培養：
     • 培養基： 配製無機鹽培養基（Minimal Salt Medium, MSM），其中碳源僅使用甲苯。甲苯可以以氣態（置於培養瓶頂部空間）或液態（少量溶解在培養基中，但需注意其揮發性和毒性）形式提供。
     • 接種： 將採集的環境樣品（如土壤懸浮液或污水）接種到含有甲苯作為唯一碳源的 MSM 培養基中。
     • 培養條件： 在適當溫度（如 25-30°C）下進行充氧培養（需通氣或振盪），以支持好氧分解。
     • 連續傳代： 培養數天後，取上清液或菌液接種到新鮮的含甲苯 MSM 培養基中，重複幾次（例如 3-5 次）。這個過程稱為富集培養，目的是篩選並增加能利用甲苯作為碳源的微生物數量。

• 步驟二：分離與純化 (Isolation and Purification)

  1. 稀釋塗抹法 (Dilution Plating)： 取富集培養後的菌液，進行一系列的梯度稀釋（例如 $10^{-1}$ 到 $10^{-7}$）。
  2. 塗抹培養： 將稀釋後的菌液分別塗抹在固體培養基上。
     • 培養基選擇： 為了獲得較好的分離效果，可以使用含有甲苯的 MSM 瓊脂平板，或使用較為通用的固體培養基（如 LB 瓊脂），然後再將平板置於含有甲苯蒸氣的環境中培養，讓微生物有機會接觸到甲苯。
     • 培養條件： 在適當溫度下培養 24-72 小時，直到菌落清晰可見。
  3. 單菌落挑取： 在平板上尋找生長良好、形態清晰的菌落。挑選看起來不同的菌落，再次進行劃線稀釋（streaking for isolation）或點滴稀釋（pour plating）到新鮮的固體培養基上，重複 2-3 次，直到獲得形態均一、且能從單一菌落生長出來的菌株。

• 步驟三：功能確認 (Functional Confirmation)

  1. 單菌落接種： 將純化得到的單菌落接種到含有甲苯的液體 MSM 培養基中。
  2. 培養與監測： 在適當條件下培養，並定期（例如每 24 小時）取樣，使用氣相層析儀 (Gas Chromatography, GC) 分析培養液中甲苯的濃度變化。如果甲苯濃度顯著下降，則證明該菌株具有分解甲苯的能力。

本題要求說明在活性污泥系統中，有哪些分子生物技術可用於快速分析微生物組成的變動，並闡述其理論依據。活性污泥系統是一個複雜的混合培養體，其微生物群落組成對處理效率至關重要，且易受操作條件（如進水負荷、溶氧量、pH、停留時間等）和環境因子影響而動態變化。分子生物技術能提供比傳統培養方法更快速、更全面的群落結構分析。

以下是幾種常用的分子生物技術及其理論依據：

1. DNA/RNA 萃取與 PCR 擴增 (DNA/RNA Extraction and PCR Amplification)

   • 理論依據： 此為許多分子生物技術的基礎。從活性污泥樣品中提取總 DNA 或 RNA，代表了該時間點的微生物群落。PCR 技術可以選擇性地放大特定基因片段（如 16S rRNA 基因），該基因在細菌和古菌中廣泛存在且序列具有物種特異性，是進行群落結構分析的常用標誌物。
   • 應用：
     • 16S rRNA 基因定序 (16S rRNA Gene Sequencing)： 擴增出的 16S rRNA 基因片段可以進一步進行 Sanger 定序或高通量定序（如 Illumina MiSeq）。通過比較序列與資料庫（如 SILVA, Greengenes, RDP）的相似度，可以鑑定群落中的微生物種類和相對豐度。
     • 定量 PCR (qPCR)： 設計特異性引子，可以定量特定類群（如硝化菌、反硝化菌）或已知種類的微生物在群落中的豐度，從而監測其動態變化。

2. 高通量定序技術 (High-Throughput Sequencing, HTS)

   • 理論依據： HTS（也稱為下一代定序，NGS）能夠同時對數百萬到數十億個 DNA 或 RNA 分子進行定序，極大地提高了分析的通量和效率。
   • 應用：
     • 16S rRNA 基因定序（16S amplicon sequencing）： 這是最常用的群落結構分析方法。通過對活性污泥樣品中的 16S rRNA 基因進行 HTS，可以獲得群落中所有細菌和古菌的分類組成信息（例如，以 OTUs - Operational Taxonomic Units 或 ASVs - Amplicon Sequence Variants 來表示）。通過比較不同時間點或不同操作條件下的定序數據，可以揭示微生物群落的結構變化。
     • 宏基因組學 (Metagenomics)： 直接對活性污泥樣本中的總 DNA 進行 HTS，無需預先擴增特定基因。這不僅可以解析微生物的分類組成，還能揭示其潛在的代謝功能基因，從而了解群落的整體功能潛力及其隨條件變化的動態。
     • 宏轉錄組學 (Metatranscriptomics)： 對活性污泥樣本中的總 RNA 進行 HTS，分析表達的 mRNA。這能反映群落中哪些基因在哪些微生物中正在被活躍轉錄，從而了解群落的實際功能活動狀態，而不是僅僅潛在的功能。

3. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

   • 理論依據： FISH 是一種將螢光標記的核酸探針（通常是針對 16S rRNA 的寡核苷酸探針）與細胞內的目標 rRNA 分子雜交，從而直接在顯微鏡下定位和識別特定微生物類群的技術。由於 rRNA 在細胞內豐度較高，且細胞內有多個拷貝，因此 FISH 具有較高的靈敏度。
   • 應用：

本題主要在探討污水地下道管線的冠頂腐蝕（crown corrosion），要求解釋其形成機制以及參與其中的微生物種類。冠頂腐蝕是污水系統中一種常見的結構破壞現象。

冠頂腐蝕 (Crown Corrosion) 的形成機制

冠頂腐蝕主要發生在污水管道的頂部區域，特別是混凝土或鋼筋混凝土結構中。其形成機制是一個多步驟的生化過程，涉及硫細菌的活動：

1. 厭氧環境下的硫化物產生： 在管道的低窪處或積水區域，由於缺乏氧氣，硫酸鹽還原菌（Sulfate-Reducing Bacteria, SRB）會利用污水中的硫酸鹽（$SO_4^{2-}$）作為電子受體，將其還原成硫化物（$S^{2-}$），主要形式是硫化氫（$H_2S$）。

   • 反應式簡化：$SO_4^{2-} + 2CH_2O \rightarrow S^{2-} + 2CO_2 + 2H_2O$ （其中 $CH_2O$ 代表有機物作為電子供體）

2. 硫化氫的釋放與氧化： 產生的硫化物（$H_2S$）在高 pH 值下以硫離子 ($S^{2-}$) 存在，但在管道頂部，通常是由於氣體交換或局部 pH 值下降，硫化氫 ($H_2S$) 會從水中揮發到管道頂部的氣相空間。這裡的氣相空間通常是潮濕的，但氧氣相對較多。

3. 硫氧化菌的活動： 在管道頂部的氣相-液相界面，存在著能夠氧化硫化氫的化學自營菌（chemolithoautotrophs），尤其是硫氧化菌 (Sulfur-Oxidizing Bacteria, SOB)。這些細菌利用氣相空間中的 $H_2S$ 作為能量來源（電子供體），並利用空氣中的氧氣作為電子受體，將 $H_2S$ 逐步氧化。

   • 第一階段氧化：$H_2S$ 被氧化成單質硫 ($S^0$) 或亞硫酸鹽 ($SO_3^{2-}$)。
   • 第二階段氧化：$S^0$ 或 $SO_3^{2-}$ 進一步被氧化成硫酸鹽 ($SO_4^{2-}$)。
   • 反應式簡化（以氧化為硫酸鹽為例）：$2H_2S + 3O_2 \rightarrow 2H_2SO_4$