112 年 國立成功大學環境工程學系碩士班丙組《微生物學》

核心觀念

本題考查**厭氧消化（Anaerobic Digestion）**的四階段代謝歷程（水解、酸生成、乙酸生成、甲烷生成）及其氣態代謝終產物。

在 UASB（上流式厭氧污泥床）反應器中，有機物（蛋白質、碳水化合物）在缺乏氧氣的環境下，經由複合厭氧菌群共同運作，最終轉化為**沼氣（Biogas）**與微量氣體。

1. 碳水化合物：主要經由糖解作用與發酵/甲烷生成作用轉化為甲烷（$\text{CH}_4$）與二氧化碳（$\text{CO}_2$）。
2. 蛋白質：水解成胺基酸後發生去胺作用（Deamination），釋放出氨氣/銨根離子，同時若廢水中含有含硫胺基酸（如半胱氨酸、甲硫氨酸）或硫酸鹽，則會經由硫酸鹽還原菌（SRB）代謝產生硫化氫（$\text{H}_2\text{S}$）。

解題方法

切入點：從主要底物的有機元素組成（$\text{C, H, O, N, S}$）推導厭氧代謝氣體產物。

在厭氧消化過程中，高分子有機物的元素最終會被還原或轉化為最穩定的氣態分子：

• 碳元素（$\text{C}$）：在厭氧還原條件下形成甲烷（$\text{CH}_4$）；在氧化還原平衡中形成二氧化碳（$\text{CO}_2$）。
• 硫元素（$\text{S}$）（來自蛋白質的含硫胺基酸）：在厭氧強還原環境中形成硫化氫（$\text{H}_2\text{S}$）。

核心觀念

本題考驗厭氧消化（Anaerobic Digestion, AD）的四階段微生物代謝機制及其在上流式厭氧污泥床（UASB）反應器中的應用。

澱粉（Starch）為高分子多醣類有機物，無法直接透過微生物細胞膜進行吸收與代謝。在 UASB 反應器內，微生物顆粒污泥（Granular Sludge）運作時，澱粉被分解至氣態最終產物（如甲烷 $\text{CH}_4$ 與二氧化碳 $\text{CO}_2$）的過程分為四大步驟：

1. 水解作用（Hydrolysis）：複合多醣分解為單醣。
2. 酸化作用 / 酵作用（Acidogenesis / Fermentation）：單醣轉化為揮發性有機酸（VFA）、醇類、$\text{CO}_2$ 與 $\text{H}_2$。
3. 乙酸產化作用（Acetogenesis）：高階揮發性有機酸與醇類經由同質乙酸菌或**互營乙酸產化菌（Syntrophic Acetogens）**轉化為乙酸（$\text{CH}_3\text{COOH}$）、$\text{H}_2$ 與 $\text{CO}_2$。
4. 甲烷產化作用（Methanogenesis）：乙酸破壞型與氫利用型產甲烷菌將代謝產物最終轉化為 $\text{CH}_4$ 與 $\text{CO}_2$ 氣體。

解題方法與完整推導

請依據厭氧消化的四個主要階段，系統化說明澱粉在 UASB 中的生物化學反應與微生物菌群分工：

階段一：水解階段（Hydrolysis）

• 機制與作用：澱粉分子結構為甘露糖/葡萄糖構成的聚合物（含 $\alpha\text{-1,4}$ 與 $\alpha\text{-1,6}$ 糖苷鍵）。胞外酶（Extracellular Enzymes，如 $\alpha$-amylase、$\beta$-amylase、Glucoamylase）由胞外水解菌分泌，將不溶性澱粉水解為小分子的可溶性單醣（主要是葡萄糖 $\text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6$）。
• 代表菌種：水解細菌（Hydrolytic bacteria，如 Clostridium spp.、Bacillus spp.）。
• 主要反應式：
  $(\text{C}_6\text{H}_{10}\text{O}_5)_n + n\text{H}_2\text{O} \rightarrow n\text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6$

階段二：酸化階段（Acidogenesis）

• 機制與作用：產酸酵菌（Fermentative / Acidogenic bacteria）吸收到葡萄糖後，於胞內進行酵代謝，將葡萄糖轉化為短鏈揮發性脂肪酸（VFA，如丁酸、丙酸、乙酸）、醇類、二氧化碳（$\text{CO}_2$）與氫氣（$\text{H}_2$）。
• 代表菌種：產酸酵細菌（如 Clostridium、Bacteroides）。
• 主要反應式（以葡萄糖轉化為乙酸與丁酸為例）：
  $\text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6 + 2\text{H}_2\text{O} \rightarrow 2\text{CH}_3\text{COOH} + 2\text{CO}_2 + 4\text{H}_2$
  $\text{C}_6\text{H}_{12}\text{O}_6 \rightarrow \text{CH}_3\text{CH}_2\text{CH}_2\text{COOH} + 2\text{CO}_2 + 2\text{H}_2$

階段三：乙酸產化階段（Acetogenesis）

• 機制與作用：在第一與第二階段產生的高階脂肪酸（如丙酸 $\text{CH}_3\text{CH}_2\text{COOH}$、丁酸）不能直接被產甲烷菌利用，需透過**專性互營產乙酸菌（Obligate Syntrophic Acetogenic Bacteria）**進行氧化，生成乙酸、$\text{H}_2$ 及 $\text{CO}_2$。
• 生化熱力學關鍵（互營作用 Syntrophy / Interspecies Hydrogen Transfer）：
  丙酸與丁酸轉化為乙酸的熱力學反應（\Delta G^\circ'）為正值（非自發）。

核心觀念

本題考查上流式厭氧污泥床（UASB）反應器中，厭氧消化（Anaerobic Digestion）四階段反應的微生物生態群落與轉化路徑，以及微生物獲得能量（ATP）的核心代謝機制——**發酵作用（Fermentation）與厭氧呼吸作用（Anaerobic Respiration）**之生化差異與最終電子接受者（Terminal Electron Acceptor, TEA）。

1. UASB 厭氧消化四階段：

   • 水解階段（Hydrolysis）：複合高分子（如蛋白質、多醣、油脂）轉化為單體（胺基酸、單醣、脂肪酸）。
   • 酸生成階段（Acidogenesis）：單體有機物發酵生成揮發性有機酸（VFA，如丁酸、丙酸）、醇類、$\text{H}_2$ 及 $\text{CO}_2$。
   • 乙酸生成階段（Acetogenesis）：VFA 與醇類由產乙酸菌轉化為乙酸、$\text{H}_2$ 及 $\text{CO}_2$。
   • 甲烷生成階段（Methanogenesis）：由古菌將乙酸、$\text{H}_2 / \text{CO}_2$ 轉化為甲烷（$\text{CH}_4$）。

2. 生物能量學（Bioenergetics）：

   • 發酵作用：底物水平磷酸化（Substrate-level phosphorylation），利用有機物本身作為電子供體與最終電子接受者，不需要外源性電子接受者與電子傳遞鏈（ETC）。
   • 厭氧呼吸作用：氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation），利用電子傳遞鏈建立跨膜質子動力（PMF），其最終電子接受者為非 $\text{O}_2$ 的外源無機物（如 $\text{NO}_3^-$, $\text{SO}_4^{2-}$, $\text{Fe}^{3+}$）或碳酸鹽。

解題方法

第一小題：UASB 中的 5 種微生物種類（含細菌域與古菌域）

UASB 反應器依賴細菌與古菌的互營共生（Syntrophy）運作，應分別列舉屬於細菌域（Domain Bacteria）與古菌域（Domain Archaea）的代表性菌種：

1. 細菌域（Domain Bacteria）：

   • Clostridium spp.（梭菌屬）：主要參與水解與酸生成階段（Acidogens），將單醣與胺基酸發酵生成有機酸（如丁酸、乙酸）、$\text{H}_2$ 與 $\text{CO}_2$。
   • Syntrophobacter wolinii：互營產乙酸菌（Propionate-oxidizing acetogen），專一將丙酸氧化分解為乙酸、$\text{H}_2$ 與 $\text{CO}_2$。
   • Syntrophomonas wolfei：互營產乙酸菌（Fatty acid-oxidizing acetogen），將長鏈揮發性脂肪酸（如丁酸）氧化生成乙酸與 $\text{H}_2$。

2. 古菌域（Domain Archaea）：

   • Methanosarcina barkeri：雙功能甲烷生成古菌（Methanogen），既可進行乙酸切碎型甲烷生成（Acetoclastic methanogenesis），也可利用 $\text{H}_2 / \text{CO}_2$ 進行氫營養型甲烷生成（Hydrogenotrophic methanogenesis）。
   • Methanobacterium formicicum：專一性氫營養型甲烷生成古菌，利用 $\text{H}_2$ 還原 $\text{CO}_2$ 生成 $\text{CH}_4$。

第二小題：發酵作用與厭氧呼吸作用之比較

將兩種能量代謝方式從電子傳遞鏈、最終電子接受者、ATP 合成方式、電子供體及能量產額（ATP 產量）等維度進行系統化比較：

核心觀念

本題旨在考驗考生對**三域系統（Three-domain system）**中兩大原核生物域——古菌（Archaea）與細菌（Bacteria）——在細胞構造與分子生物學特徵上的比較。

重點觀念包含：

1. 細胞膜（Cell Membrane）構造：包括脂質分子中甘油與脂肪酸（或類異戊二烯）之間的鏈結類型（酯鍵 vs. 醚鍵）、甘油立體異構體（G-3-P vs. G-1-P）、烴鏈結構（直鏈脂肪酸 vs. 分枝狀類異戊二烯/Phytanyl），以及膜雙層（Bilayer）與膜單層（Monolayer）的差異。
2. 細胞壁（Cell Wall）成分：細菌具備典型的肽聚醣（Peptidoglycan / Murein），含有 $N$-乙醯麩氨基葡萄糖（NAG）與 $N$-乙醯胞壁酸（NAM），並以 $\beta-1,4$ 醣苷鍵相連；古菌則無真肽聚醣，細胞壁成分多樣，如假肽聚醣（Pseudopeptidoglycan / Pseudomurein）（由 NAG 與 $N$-乙醯塔羅糖氨尿酸（NAT）以 $\beta-1,3$ 醣苷鍵相連）、蛋白質/醣蛋白構成的 S-層（S-layer） 或複合多醣（如 Methanochondroitin）。
3. 核醣體（Ribosome）與 SSU rRNA：原核生物（古菌與細菌）之沉降係數（Svedberg unit, S）與 rRNA 構成比較。

解題方法

採用「系統化條列與對照表」的方式進行解答。針對題目要求的兩大重點：

1. 細胞膜與細胞壁結構比較（15分）：分別從「細胞膜的化學鍵結與脂質鏈」、「細胞膜雙層/單層型態」、「細胞壁化學成分與醣苷鍵結」三個維度深入比較古菌與細菌的差異。
2. 核醣體與小次單元 rRNA 大小比較（6分）：精準列出兩者的核醣體整體沉降係數（70S）、大小次單元構成，以及小次單元 rRNA（16S rRNA）之沉降係數與鹼基長度。

詳細解答

一、古菌與細菌之細胞膜與細胞壁結構比較

1. 細胞膜構造（Cell Membrane Structure）

古菌與細菌的細胞膜雖然皆擔任通透障壁（Permeability barrier）的功能，但在化學組成上存在三個關鍵差異：

• 甘油與疏水鏈之鍵結類型：
  • 細菌（Bacteria）：甘油與脂肪酸（Fatty acids）之間以**酯鍵（Ester linkage）**相連。
  • 古菌（Archaea）：甘油與疏水側鏈之間以**醚鍵（Ether linkage）**相連。醚鍵在化學性質上比酯鍵更穩定，能耐受高溫、極端酸鹼或高鹽環境。
• 疏水側鏈（Hydrophobic Side Chain）化學結構：
  • 細菌：由未分枝的**直鏈脂肪酸（Unbranched fatty acids）**組成。
  • 古菌：由異戊二烯（Isoprene）單元聚合而成的**分枝狀類異戊二烯鏈（Branched isoprenoid chains）**組成（例如植烷基 Phytanyl）。
• 甘油立體骨架與膜層型態（Membrane Layering）：
  • 細菌：磷脂質以 L-甘油-3-磷酸（Glycerol-3-phosphate, G3P） 為骨架，形成標準的脂質雙層膜（Lipid bilayer）。
  • 古菌：磷脂質以 D-甘油-1-磷酸（Glycerol-1-phosphate, G1P） 為骨架。部分極端嗜熱古菌（Thermophilic Archaea）的雙端植烷基（Biphytanyl）可貫穿細胞膜兩端，形成脂質單層膜（Lipid monolayer），大幅提升膜在極端高溫下的結構穩定性。

2. 細胞壁結構（Cell Wall Structure）

• 細菌（Bacteria）：
  • 主要成分為肽聚醣（Peptidoglycan / Murein）。
  • 骨架由 $N$-乙醯麩氨基葡萄糖（$N$-acetylglucosamine, NAG）與 $N$-乙醯胞壁酸（$N$-acetylmuramic acid, NAM）交替交聯而成，其鍵結方式為 $\beta-1,4$ 醣苷鍵（$\beta-1,4$ glycosidic bond）（可被溶菌酶 Lysozyme 切割）。
  • 含 D-型胺基酸（D-amino acids）參與胜肽交聯。
• 古菌（Archaea）：
  • 不含真肽聚醣（No true peptidoglycan），亦不含 $N$-乙醯胞壁酸（NAM）及 D-型胺基酸，因此對抗生素青黴素（Penicillin）及溶菌酶具有天然抗性。
  • 細胞壁成分呈現多樣性：

核心觀念

本題旨在考察環境微生物學與分子生物技術在廢水處理領域的實際應用。主要觀念包含：

1. 空間分佈探測需求：在 UASB（Upflow Anaerobic Sludge Bed, 上流式厭氧污泥床）反應器中，微生物會形成緻密的厭氧污泥顆粒（Anaerobic Granular Sludge）。由於顆粒內部存在氧氣與底物（如有機酸、氫氣、二氧化碳等）的濃度梯度與傳質阻力，不同生理功能的關鍵菌群（如水解菌、產酸菌、產乙酸菌、產甲烷菌）會在污泥顆粒內部呈現空間分層（Spatial Distribution）。
2. 免培養（Culture-Independent）原位探測技術：傳統培養法無法保持顆粒的空間結構，因此探測微米級空間分佈必須依賴螢光原位雜交法（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）。該技術結合 16S rRNA 專一性核酸探針與螢光顯微鏡（或共焦雷射掃描顯微鏡, CLSM），能在不破壞細胞結構與空間關係的前提下，對目標菌群進行原位定位與定量分析。

解題方法

1. 建議方法

建議採用螢光原位雜交法（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）配合共焦雷射掃描顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）。

2. 方法原理與操作步驟說明

FISH 技術結合了分子生物學的專一性與顯微技術的空間成像能力，其原理與主要操作流程如下：

• 目標分子與探針設計：
  選定核糖體 16S rRNA 作為分子標記。由於活細胞內含有大量的 16S rRNA，且不同菌群（例如：產甲烷八疊球菌 Methanosarcina 或產甲烷絲菌 Methanothrix）具有專一性的序列區域，因此可設計與目標菌群 16S rRNA 序列互補的短鏈 DNA 探針（Oligonucleotide Probe），並在其端點標記螢光染劑（如 Cy3、Cy5 或 FITC）。
• 樣品固定與切片（Fixation and Sectioning）：
  取 UASB 污泥顆粒，使用固定劑（如 4% 多聚甲醛 Paraformaldehyde, PFA）進行細胞固定，使其蛋白質 cross-link 以保持細胞結構與空間完整性。

核心觀念

本題考驗微生物生理學與微生物生態學中的核心機制：菌量感應（Quorum Sensing, QS）。
Quorum sensing 是細菌等微生物利用小分子化學訊號進行「細胞間溝通（Cell-to-cell communication）」的生理調控機制。其核心觀念包括：

1. 濃度依存性（Density-dependent mechanism）：微生物個體會持續分泌低濃度的訊號分子（稱為訊號誘導物 Autoinducer, AI）。當菌群密度低時，訊號分子擴散稀釋，無法引發反應；當菌群密度達到特定臨界閾值（Quorum）時，環境中的訊號分子濃度累積至足以與受體結合，進而誘發或抑制下游特定基因的表達。
2. 群體行為調控（Group behaviors）：藉由 Quorum sensing，微小的單細胞生物能夠協調群體行為，展現出類似多細胞生物的組織性活性（例如：生物膜形成 Biofilm formation、生物發光 Bioluminescence、毒力因子釋放 Virulence factor expression、胞外聚合物 EPS 分泌等）。
3. 在 UASB 厭氧廢水處理中的意義：題幹提到的 UASB 反應器中，微生物之所以能形成結構緊密且代謝高效的「顆粒污泥（Granular sludge）」，Quorum sensing 在促進細菌間的黏附、EPS（胞外聚合物）代謝分泌以及共生菌群（如乙酸生成菌與產甲烷菌）的種間傳質與結構發育上扮演關鍵的角色。

解題方法

回答本題應從定義機制、作用流程與調控機制分類三個維度進行系統化說明：

1. Quorum sensing 的定義與原理：

   • 指出 QS 是一種微生物依據「菌群密度（Population density）」變化來調節特定基因表達的通訊機制。
   • 說明訊號分子（Autoinducer, AI）的積累過程以及達到臨界濃度（Quorum）時的基因啟動效應。

2. Quorum sensing 調控微生物活動的具體機制與步驟：

   • 步驟一：訊號合成與釋放：細菌細胞持續合成並向胞外釋放訊號分子（如革蘭氏陰性菌常見的 N-Acyl homoserine lactones, AHLs；革蘭氏陽性菌的寡肽 Autoinducing peptides, AIPs；以及跨物種通訊的 Autoinducer-2, AI-2）。
   • 步驟二：訊號累積與感應：隨著微生物密度增加，胞外訊號分子濃度上升。達到閾值後，訊號分子與細胞表面或胞內的特定受體蛋白結合。
   • 步驟三：基因表達與群體運作：受體被活化後作為轉錄因子（或啟動雙元件傳遞系統），啟動特定標的基因群的轉錄，調節代謝與生理活動。

核心觀念

本題考查**微生物生長動力學（Microbial Growth Kinetics）**中極為經典且重要的 Monod 模型（Monod Model）。

Monod 模型由法國微生物學家 Jacques Monod 於 1942 年提出，用於描述在限制性基質（Limiting Substrate）存在下，懸浮培養微生物的**比生長速率（Specific Growth Rate, $\mu$）與環境中限制性基質濃度（Substrate Concentration, $S$）**之間的半經驗雙曲線關係（Semi-empirical Hyperbolic Relationship）。其數學表達式與酶動力學中的 米氏方程（Michaelis-Menten Equation） 具有相同的數學形式。

Monod 模型數學表達式

$\mu = \mu_{\max} \frac{S}{K_s + S}$

解題方法

本題為說明題，切入點應包含：

1. 方程式各參數之物理／生物學意義說明。
2. 基質濃度 $S$ 在極端情況下（高濃度與低濃度）之動力學行為討論（反應級數）。
3. 配合圖像說明（曲線圖），協助觀念擬真。

1. 參數與係數意義

• $\mu$（Specific Growth Rate, 比生長速率）

  • 定義：單位時間內單位微生物生物量的增加量。
  • 單位：$\text{hr}^{-1}$ 或 $\text{day}^{-1}$。
  • 式子：$\mu = \frac{1}{X}\frac{dX}{dt}$（其中 $X$ 為微生物生物量濃度）。

• $\mu_{\max}$（Maximum Specific Growth Rate, 最大比生長速率）

  • 定義：在基質極度充足（$S \gg K_s$）且無任何抑制因素、環境條件（pH、溫度等）最適化時，微生物所能達到的最大比生長速率。
  • 單位：$\text{hr}^{-1}$ 或 $\text{day}^{-1}$。

• $S$（Substrate Concentration, 限制性基質濃度）

  • 定義：環境中控制微生物生長速率之主要限制性營養素（如有機碳源、氮源、磷源等）的濃度。
  • 單位：$\text{mg/L}$（以 COD、BOD 或特定化合物表示）。

• $K_s$（Half-velocity Constant / Affinity Constant, 半速率常數／親和力常數）

  • 定義：當微生物比生長速率達到最大比生長速率一半（即 $\mu = 0.5 \mu_{\max}$）時所需的基質濃度。
  • 單位：$\text{mg/L}$。
  • 物理意義：代表微生物對該基質的親和力（Affinity）。
    • $K_s$ 越小：表示微生物在極低基質濃度下即可達到高生長速率，對基質親和力高（常見於寡營養菌/K-strategy 微生物）。