109 年 國立成功大學環境工程學系碩士班丙組《微生物學》

本題主要在測試考生對微生物學中重要專有名詞的理解，以及這些名詞所代表的生物學過程或現象之間的關聯性。

(a) Comammox and Nitrification

• Comammox (Complete Ammonia Oxidation): 意指「完全氨氧化」。這是一個新發現的微生物過程，由一種稱為 Candidatus Nitrospira inopinata 的細菌完成。Comammox 過程能夠將氨 (ammonia, $NH_3$) 直接氧化成硝酸鹽 (nitrate, $NO_3^-$)，一步完成傳統上需要兩類細菌協同作用的氨氧化過程。

• Nitrification (硝化作用): 這是指將氨氧化成亞硝酸鹽 (nitrite, $NO_2^-$) 的過程，通常由氨氧化菌 (Ammonia-Oxidizing Bacteria, AOB) 或氨氧化古菌 (Ammonia-Oxidizing Archaea, AOA) 完成，反應式為 $NH_3 + \frac{3}{2} O_2 \rightarrow NO_2^- + H_2O + H^+$。接著，亞硝酸鹽會被亞硝酸鹽氧化菌 (Nitrite-Oxidizing Bacteria, NOB) 氧化成硝酸鹽，反應式為 $NO_2^- + \frac{1}{2} O_2 \rightarrow NO_3^-$。

• 關係: Nitrification 是傳統上將氨轉化為硝酸鹽的兩步驟過程。Comammox 則是一個單一步驟的過程，由單一微生物完成氨到硝酸鹽的轉換，因此是 Nitrification 的一種特殊形式或替代路徑。Comammox 的發現改變了我們對氮循環中氨氧化過程的傳統認知。

(b) Anammox and Denitrification

• Anammox (Anaerobic Ammonia Oxidation): 意指「厭氧氨氧化」。這是一個厭氧過程，其中氨 (ammonia, $NH_3$) 和亞硝酸鹽 (nitrite, $NO_2^-$) 在厭氧條件下反應生成氮氣 (nitrogen gas, $N_2$) 和水 (water, $H_2O$)，反應式大致為 $NH_3 + NO_2^- \rightarrow N_2 + 2H_2O$。這個過程主要由一種稱為「厭氧氨氧化菌」(Anammox bacteria) 的專性厭氧菌完成。

• Denitrification (脫氮作用): 這是一個將硝酸鹽 (nitrate, $NO_3^-$) 或亞硝酸鹽 (nitrite, $NO_2^-$) 逐步還原成氮氣 (nitrogen gas, $N_2$) 的過程，通常發生在缺氧或厭氧條件下，由多樣化的脫氮菌完成。完整的脫氮過程包括：$NO_3^- \rightarrow NO_2^- \rightarrow NO \rightarrow N_2O \rightarrow N_2$。

• 關係: Anammox 和 Denitrification 都是將含氮化合物轉化為氮氣的過程，在氮循環中扮演著移除總氮的角色。兩者皆能在厭氧環境中進行。然而，Anammox 消耗的底物是氨和亞硝酸鹽，而 Denitrification 主要消耗硝酸鹽和亞硝酸鹽。Anammox 過程具有更高的氮移除效率，且不產生中間產物一氧化二氮 ($N_2O$)，這是一種溫室氣體，因此在廢水處理中，Anammox 工藝因其節能和環保特性受到重視。兩者常常在廢水處理系統中協同作用，以達到高效的總氮去除。

(c) Co-metabolism and Bioremediation

• Co-metabolism (共代謝): 指一種微生物代謝現象，其中一種化合物的轉化或降解，需要另一種化合物（通常是主要的能量和碳源，稱為「推動底物」或「推動劑」）的存在。在共代謝過程中，轉化某化合物的酶是由推動底物誘導產生的，而該化合物本身並不能為微生物提供能量或碳源。因此，這種轉化是「附帶」發生的。
• Bioremediation (生物復育): 指利用生物體（主要是微生物，但也包括植物）來降解或移除環境中的污染物，以恢復受污染環境的過程。這是一種環境友善的污染處理技術。

本題主要測試考生對厭氧發酵過程中的微生物群落組成、古菌與真細菌的結構差異，以及微生物分離培養技術的掌握程度。

(a) 厭氧發酵槽中的古菌與真菌的例子、角色與互動關係

厭氧發酵是將複雜有機物轉化為甲烷（主要成分是 $CH_4$）和二氧化碳 ($CO_2$) 的過程，通常涉及水解、酸化、醋酸生成和甲烷生成等多個階段。古菌主要參與最後的甲烷生成階段，而真菌則在水解和酸化階段扮演重要角色。

• 古菌 (Archaea) 例子與角色:

  1. 屬名 (Genus Name): Methanobrevibacter
     • 角色: 這是一類常見的產甲烷菌，主要將醋酸 (acetate) 或其他簡單有機酸（如丙酸、丁酸）分解產生甲烷和二氧化碳，或直接利用氫氣 ($H_2$) 和二氧化碳生成甲烷。在厭氧發酵中，Methanobrevibacter 負責將前階段產生的揮發性脂肪酸和氫氣轉化為甲烷，是甲烷生成的關鍵參與者。
  2. 屬名 (Genus Name): Methanosarcina
     • 角色: Methanosarcina 是一類非常活躍的產甲烷菌，它們能利用多種底物產甲烷，包括醋酸（通過裂醋酸產甲烷，$CH_3COOH \rightarrow CH_4 + CO_2$）、氫氣和二氧化碳（$CO_2 + 4H_2 \rightarrow CH_4 + 2H_2O$），以及甲基化化合物（如甲醇）。它們在厭氧發酵中扮演著重要的角色，能夠適應不同的底物條件，並有效轉化有機物為甲烷。

• 真細菌 (Bacteria) 例子與角色:

  1. 屬名 (Genus Name): Clostridium
     • 角色: 這是一類常見的厭氧性或兼性厭氧性真細菌，在厭氧發酵的早期階段（水解和酸化）扮演關鍵角色。它們能夠分解複雜的有機聚合物，如纖維素、蛋白質和脂質，生成簡單的有機酸（如醋酸、丙酸、丁酸）、醇、氫氣和二氧化碳。例如，Clostridium butyricum 可以將糖類發酵產生丁酸。
  2. 屬名 (Genus Name): Bacteroides
     • 角色: Bacteroides 是一類專性厭氧真細菌，在水解階段非常重要，特別是對於分解複雜的碳水化合物。它們能分泌胞外酶來分解多醣，並將其轉化為單醣或其他可發酵的產物，為後續的產酸菌和產甲烷菌提供底物。

• 互動關係:

  • 共生關係: 真細菌（如 Clostridium 和 Bacteroides）通過水解複雜有機物，產生小分子有機酸、氫氣和二氧化碳，為古菌（如 Methanobrevibacter 和 Methanosarcina）提供產甲烷所需的底物。
  • 底物競爭與協同: 在某些情況下，一些真細菌和古菌可能競爭氫氣。然而，更常見的是協同作用，例如，產氫細菌（如某些厭氧菌）產生的氫氣被產甲烷菌消耗，從而促進了產氫菌的反應進行（還原性終產物移除）。
  • pH 影響: 真細菌產生的有機酸會降低 pH 值，這對厭氧發酵的穩定性至關重要。過低的 pH 值會抑制產甲烷菌的活性，而適當的 pH 值則有利於整個過程的進行。

(b) 古生菌和真細菌的細胞壁與細胞膜結構差異

古生菌和真細菌在細胞壁和細胞膜的結構上存在顯著差異，這也是區分兩者的重要依據。

• 細胞壁 (Cell Wall):

  • 古菌 (Archaea):
    • 成分: 大多數古菌的細胞壁主要成分是擬肽聚醣 (Pseudopeptidoglycan) 或類肽聚醣 (Peptidoglycan-like) 結構，其結構與真細菌的肽聚醣不同。例如，其醣鏈中的醣類結構可能不同（如 L-艾杜糖醛酸取代 D-葡萄糖醛酸），且其胺基酸組成也不相同，不含 D-胺基酸，而是含有 L-胺基酸。
    • 有無肽聚醣: 沒有傳統意義上的肽聚醣。
    • 其他成分: 有些古菌細胞壁由蛋白質或醣蛋白組成，形成一個蛋白質層 (S-layer)，這是最常見的細胞壁類型。
    • 範例: 殼藻菌門 (Euryarchaeota) 的細胞壁組成多樣，有些有 S-layer，有些有其他多醣或蛋白質。
  • 真細菌 (Bacteria):
    • 成分: 大多數真細菌的細胞壁含有肽聚醣 (Peptidoglycan)，這是一種由 N-乙醯葡糖胺 (NAG) 和 N-乙醯胞壁酸 (NAM) 構成的長鏈，通過 β-(1,4) 糖苷鍵連接，並由短肽鏈交聯而成。肽聚醣是細胞壁的主要結構成分，提供細胞形狀和滲透壓保護。
    • 有無肽聚醣: 有肽聚醣。
    • 種類: 根據肽聚醣層的厚度和外膜的存在，可分為革蘭氏陽性菌（厚肽聚醣層，無外膜）和革蘭氏陰性菌（薄肽聚醣層，有外膜）。
    • 範例: Escherichia coli (革蘭氏陰性菌)，Staphylococcus aureus (革蘭氏陽性菌)。

• 細胞膜 (Cell Membrane):

  • 古菌 (Archaea):
    • 脂質結構: 古菌細胞膜的脂質結構非常獨特。其脂質分子是醚鍵 (ether linkage) 連接的異戊二烯單位 (isoprenoid units)，而不是真細菌和真核生物中的酯鍵 (ester linkage)。
    • 脂肪鏈: 脂肪鏈是支鏈的異戊二烯，而不是直鏈的脂肪酸。
    • 單層膜: 在某些極端環境中的古菌，其細胞膜脂質的兩個頭基之間可能通過醚鍵連接，形成一個單層膜 (monolayer)，而不是雙層膜 (bilayer)，這增加了膜的穩定性。
    • 頭基: 頭基結構多樣，可能包括磷酸基、醣類，或不含磷酸基。

本題主要在測試考生對 qPCR 技術的原理及其在環境微生物學應用方面的理解，特別是利用 qPCR 進行環境污染物降解菌的定量分析。

qPCR 方法的原理

定量聚合酶鏈反應 (qPCR)，又稱為即時定量 PCR (Real-time quantitative PCR)，是一種在 PCR 擴增過程中，實時監測 PCR 產物（DNA）量的技術。其基本原理是利用螢光信號來量化 DNA 的產生。

1. PCR 擴增: qPCR 與傳統 PCR 一樣，依賴於 DNA 聚合酶、引物 (primers)、dNTPs 和模板 DNA。在熱循環儀中，通過變性、退火和延伸三個步驟，目標 DNA 片段被指數級擴增。
2. 螢光信號檢測: qPCR 的關鍵在於引入了螢光信號檢測機制。這通常通過兩種主要方式實現：
   • 染料法 (Dye-based method): 使用一種能夠特異性結合雙鏈 DNA 的螢光染料，如 SYBR Green I。SYBR Green I 在結合雙鏈 DNA 後會發出螢光。隨著 PCR 產物的增加，結合的染料量也增加，從而引起螢光強度的增強。這種方法簡單、成本低，但 SYBR Green I 也可能結合非特異性產物，因此需要進一步的熔解曲線分析來驗證產物的特異性。
   • 探針法 (Probe-based method): 使用一段寡核苷酸探針，該探針序列與 PCR 擴增的目標序列之間的部分區域有同源性，並且探針帶有螢光報告基團 (reporter dye) 和淬滅基團 (quencher dye)。在探針與模板 DNA 結合後，報告基團和淬滅基團的距離較近，螢光信號被淬滅。當 DNA 聚合酶在延伸步驟中遇到結合的探針時，其 5' 核酸酶活性會切斷探針，使報告基團與淬滅基團分離，從而釋放出螢光信號。最常見的探針技術是 TaqMan 探針。探針法具有更高的特異性和靈敏度，可以有效避免非特異性 PCR 產物的干擾。
3. 螢光信號與產量相關性: 在 PCR 的每個循環結束時，qPCR 儀器都會檢測螢光信號的強度。隨著 PCR 循環次數的增加，目標 DNA 的量呈指數級增長，螢光信號的強度也隨之增強。
4. 閾值循環數 (Ct value): qPCR 的核心參數是閾值循環數 (Cycle threshold, $C_t$)，也稱為定量循環數 (Quantification cycle, $C_q$)。$C_t$ 值是指螢光信號第一次達到預設的「閾值」(threshold) 時所需的 PCR 循環次數。這個閾值通常設定在指數擴增階段的後期。
   • $C_t$ 值與模板量的關係: 模板 DNA 的起始量越高，PCR 擴增達到閾值所需的循環次數就越少，即 $C_t$ 值越低。反之，起始模板量越低，達到閾值所需的循環次數就越多，$C_t$ 值越高。這種指數級的擴增關係使得 qPCR 能夠精確地定量起始模板 DNA 的量。
5. 定量分析: 通過建立一個標準曲線，將已知的起始 DNA 濃度（或拷貝數）對應其測得的 $C_t$ 值，可以反推出樣品中未知 DNA 的起始量。

利用 qPCR 分析地下水中 Dehalococcoides 的數量

Dehalococcoides 屬的細菌是能夠進行厭氧脫氯反應的關鍵微生物，它們能將三氯乙烯 (TCE) 等氯代烴污染物完全脫氯為乙烯 (ethene)，是一種重要的生物修復菌。利用 qPCR 分析地下水中 Dehalococcoides 的數量，可以評估該菌種在此環境中的豐度，進而預測其對 TCE 污染物的降解潛力。

本題考查考生對微生物生長動力學中 Monod 模式的理解，包括模式的數學表達式、各參數的意義及其在描述細菌生長中的應用。

Monod 模式

Monod 模式是由 Jacques Monod 在 1940 年代提出的，用於描述在穩態條件下，微生物（如細菌）的比生長速率 ($\mu$) 與底物（基質）濃度 ($S$) 之間的關係。該模式是一個經驗性的數學模型，廣泛應用於微生物學、生物工程和環境工程領域。

• 數學表達式:

  $\mu = \mu_{max} \frac{S}{K_s + S}$

  其中：

  • $\mu$: 微生物的比生長速率 (specific growth rate)，單位通常是 $h^{-1}$ (每小時)。它表示單位生物量在單位時間內增加的速率。
  • $\mu_{max}$: 最大比生長速率 (maximum specific growth rate)，單位是 $h^{-1}$。這是當底物濃度足夠高時，微生物能達到的最高比生長速率。
  • $S$: 底物（基質）的濃度，單位通常是質量/體積（如 $g/L$ 或 $mg/L$）。
  • $K_s$: 半飽和常數 (half-saturation constant)，單位是質量/體積（與 $S$ 相同）。$K_s$ 是指當比生長速率 $\mu$ 等於最大比生長速率 $\mu_{max}$ 的一半時，底物 $S$ 的濃度。

• 各項參數的意義:

  1. $\mu_{max}$ (最大比生長速率):

     • 意義: 代表了該微生物在特定環境條件（如溫度、pH、營養充足）下，利用特定底物所能表現出的最快生長潛力。它反映了微生物的遺傳特性和生理狀態。
     • 應用: 在設計生物反應器或預測微生物群落生長極限時非常重要。例如，在污水處理中，不同菌種的最大生長速率決定了它們在反應器中的停留時間要求。

  2. $K_s$ (半飽和常數):

     • 意義: $K_s$ 是衡量微生物對底物親和力 (affinity) 的指標。
       • 低 $K_s$ 值: 表示微生物對該底物具有較高的親和力。即使在較低的底物濃度下，也能維持較高的比生長速率。這意味著該微生物在貧營養環境中具有競爭優勢。
       • 高 $K_s$ 值: 表示微生物對該底物具有較低的親和力。