111 年 國立成功大學環境工程學系碩士班丙組《微生物學》

本題考查厭氧發酵的微生物學原理，重點在於理解厭氧環境下微生物如何分解有機物並產生最終產物。

厭氧發酵是微生物在無氧或極低氧氣環境下，將複雜有機物分解為簡單無機物或小分子有機物的過程，主要產物通常包括甲烷 ($CH_4$)、二氧化碳 ($CO_2$)、硫化氫 ($H_2S$)、氨 ($NH_3$) 等。此過程是多個微生物群落協同作用的結果，可以分為以下幾個階段：

1. 水解 (Hydrolysis)：此階段由厭氧水解菌負責。它們分泌胞外酶，將大分子有機物（如碳水化合物、蛋白質、脂質）分解為可溶性的、較小的分子，如單醣、胜肽、脂肪酸等。

   • 例如：碳水化合物 (多醣) $\rightarrow$ 單醣 $\rightarrow$ 脂肪酸、乙醇、乳酸等。
   • 蛋白質 $\rightarrow$ 胜肽 $\rightarrow$ 胺基酸 $\rightarrow$ 脂肪酸、氨等。
   • 脂質 $\rightarrow$ 脂肪酸、甘油 $\rightarrow$ 脂肪酸等。

2. 酸化 (Acidogenesis)：此階段由厭氧產酸菌負責。它們將水解階段產生的可溶性有機物（如單醣、胺基酸、脂肪酸）進一步分解，產生揮發性脂肪酸 (Volatile Fatty Acids, VFAs，如醋酸、丙酸、丁酸)、醇類 (如乙醇)、乳酸、氫氣 ($H_2$)、二氧化碳 ($CO_2$) 等。

3. 產乙酸 (Acetogenesis)：此階段由厭氧產乙酸菌負責。它們將酸化階段產生的揮發性脂肪酸和醇類，特別是丙酸、丁酸等，進一步轉化為醋酸 ($CH_3COOH$)、氫氣 ($H_2$) 和二氧化碳 ($CO_2$)。

本題考查細菌與古菌在細胞膜與細胞壁結構上的差異，這是區分這兩大原核生物類群的重要特徵。

細菌 (Bacteria) 和古菌 (Archaea) 雖然同屬於原核生物，但在細胞膜和細胞壁的結構上存在顯著差異：

細胞膜 (Cell Membrane)

• 細菌 (Bacteria)：

  • 脂質組成：細胞膜的脂質雙層主要由甘油磷脂 (glycerophospholipids) 組成。脂肪酸鏈是通過酯鍵 (ester linkage) 連接到甘油分子上的。脂肪酸鏈通常是直鏈的，且可以是不飽和的。
  • 膜結構：典型的脂質雙層結構。

• 古菌 (Archaea)：

  • 脂質組成：細胞膜的脂質組成非常獨特。
    • 連接方式：甘油與脂質鏈之間的連接方式是醚鍵 (ether linkage)，而不是酯鍵。
    • 脂質鏈：脂質鏈通常是異戊二烯單元 (isoprenoid units) 組成的，而不是脂肪酸。這些異戊二烯鏈可以是直鏈的，也可以是分支的。
    • 結構形式：古菌的細胞膜可以形成脂質雙層 (lipid bilayer)，類似於細菌，但更常見的是形成脂質單層 (lipid monolayer)。在單層結構中，兩個甘油分子通過醚鍵連接到一個脂質鏈的兩端，形成一個連續的結構，這使得膜在極端環境下更加穩定。
  • 膜結構：可以是脂質雙層或脂質單層。

細胞壁 (Cell Wall)

本題要求列舉厭氧發酵過程中常見的古菌屬名。厭氧發酵的最終產物甲烷，其產生者為產甲烷菌，而產甲烷菌均屬於古菌域。

在厭氧發酵的過程中，特別是在處理畜牧廢棄物（如豬糞尿）時，產甲烷菌扮演著至關重要的角色。常見的產甲烷菌屬包括：

1. Methanosarcina (甲烷絲菌屬)：這是非常多樣化且重要的產甲烷菌屬，能夠利用醋酸、氫氣和二氧化碳進行產甲烷。它們在多種厭氧環境中都十分活躍。
2. Methanobacterium (甲烷桿菌屬)：這是一個常見的產甲烷菌屬，主要利用氫氣和二氧化碳進行產甲烷。

本題考查細菌與古菌在厭氧發酵過程中的共營關係，並要求從熱力學角度進行解釋。共營 (Syntrophy) 指的是兩種或多種微生物在共同代謝過程中相互依賴，一種微生物的代謝產物是另一種微生物的底物，且單獨進行時不利或無法進行的反應，藉由協同作用變得可行。

在厭氧發酵中，細菌和古菌的共營關係體現在幾個關鍵環節，其中最典型的是產氫菌和產甲烷菌之間的協同作用。

熱力學解釋共營關係 (Syntrophy)：

共營關係的發生，關鍵在於反應的吉布斯自由能變化 ($\Delta G$)。一個反應若要自發進行，其 $\Delta G$ 必須為負值。然而，在某些情況下，單獨進行的反應其 $\Delta G$ 可能為正值或接近零，無法順利進行。此時，若存在另一種微生物能夠消耗掉反應產生的某種物質，從而降低產物濃度，則可以降低反應的自由能變化，使其變得負值，從而實現自發進行。

在厭氧發酵中，細菌（主要是產酸菌和產乙酸菌）負責將複雜有機物分解為醋酸 ($CH_3COOH$)、氫氣 ($H_2$) 和二氧化碳 ($CO_2$)。其中，氫氣的產生是一個關鍵的環節。

• 產氫菌 (Bacterial acidogens/acetogens)：這些細菌將有機酸（如丙酸、丁酸）氧化生成醋酸、二氧化碳和氫氣。例如，丁酸的氧化反應：
  $CH_3CH_2CH_2COOH + 2H_2O \rightarrow 2CH_3COOH + 2H_2$
  在標準狀態下 ($\Delta G^0$)，此反應的自由能變化是略為正值或接近零的，這表示在一般條件下，此反應不容易自發進行。

• 產甲烷菌 (Archaea methanogens)：這些古菌可以利用氫氣和二氧化碳合成甲烷。例如，利用氫氣和二氧化碳產甲烷的反應：

本題共分為兩部分：第一部分詢問蛋白質有機氮在厭氧發酵下的最終產物；第二部分則要求說明蛋白質厭氧發酵產物進入活性污泥後的分解轉換過程。

第一部分：蛋白質有機氮厭氧分解的最終產物 (3pts)

蛋白質是由胺基酸組成的，其中含有有機氮。在厭氧發酵過程中，蛋白質有機氮的分解是一個多步驟的過程，主要由厭氧菌群完成。

1. 水解 (Hydrolysis)：首先，蛋白質被厭氧水解菌分泌的蛋白酶分解為多肽和胺基酸。
2. 脫胺 (Deamination)：胺基酸隨後被厭氧脫胺菌分解。胺基酸的胺基 (-NH2) 被去除，釋放出氨 ($NH_3$)，碳骨架則被進一步轉化為揮發性脂肪酸 (VFAs)、二氧化碳 ($CO_2$)、氫氣 ($H_2$) 等。
   • 胺基酸 $\rightarrow$ 揮發性脂肪酸 + $CO_2$ + $NH_3$ + $H_2$

因此，蛋白質有機氮在厭氧分解過程中的最終產物是 氨 ($NH_3$) (以銨離子 $NH_4^+$ 形式存在於水中) 以及各種揮發性脂肪酸、二氧化碳、甲烷等。題目特別問「蛋白質有機氮分解至何最終產物」，最直接與有機氮相關的最終產物是氨。

第二部分：蛋白質厭氧發酵產物進入活性污泥後的分解轉換過程 (10pts)

活性污泥法是一種好氧處理過程，其中包含多種微生物（細菌、真菌、原生動物、後生動物等）。當蛋白質厭氧發酵產物（主要是揮發性脂肪酸、氨、小分子有機物等）進入活性污泥系統時，它們會被這些好氧微生物利用。

分解轉換過程如下：

1. 揮發性脂肪酸 (VFAs) 和小分子有機物的分解：

   • 好氧氧化：活性污泥中的好氧細菌會迅速利用這些有機物作為碳源和能源。通過好氧呼吸作用，VFAs 和其他小分子有機物被氧化分解為二氧化碳 ($CO_2$)、水 ($H_2O$) 和能量。
     • 例如：醋酸氧化：$CH_3COOH + 2O_2 \rightarrow 2CO_2 + 2H_2O$
   • 微生物增殖：分解這些有機物的細菌會增殖，形成活性污泥絮凝體的一部分。

2. 氨 ($NH_3$) 的轉化：

   • 硝化作用 (Nitrification)：進入活性污泥的氨，在好氧條件下，會被硝化細菌（如 Nitrosomonas 和 Nitrobacter）轉化。

本題考查含氮化物在缺氧條件下產生的溫室氣體，以及生物除氮的兩種方法及其相關菌群。

第一部分：缺氧條件下含氮化物產生的溫室氣體 (4pts)

在含氮廢水，特別是富含硝酸鹽 ($NO_3^-$) 或亞硝酸鹽 ($NO_2^-$) 的情況下，若進入缺氧或厭氧環境，會發生反硝化作用。反硝化作用的最終產物可以是氮氣 ($N_2$)，但若條件不完全，或有其他微生物參與，則可能產生一氧化二氮 ($N_2O$)，這是一種強效的溫室氣體。

• 名稱：一氧化二氮
• 化學式：$N_2O$

一氧化二氮的溫室效應潛力約為二氧化碳的 300 倍，且在大氣中壽命較長，因此對全球暖化有顯著影響。

第二部分：兩種生物除氮的方法及其化學方程式 (10pts)

生物除氮是通過微生物的代謝作用，將廢水中的氮素（主要是氨氮 $NH_4^+$、亞硝酸鹽 $NO_2^-$、硝酸鹽 $NO_3^-$）轉化為氮氣 ($N_2$) 並從水中去除的過程。主要包括硝化作用和反硝化作用。

1. 硝化作用 (Nitrification)：

   • 定義：在好氧條件下，氨氮 ($NH_4^+$) 被硝化細菌氧化為亞硝酸鹽 ($NO_2^-$)，再被硝化細菌氧化為硝酸鹽 ($NO_3^-$)。
   • 化學方程式：
     • 亞硝化 (Ammonia oxidation to nitrite)：
       $2NH_4^+ + 3O_2 \rightarrow 2NO_2^- + 2H_2O + 4H^+$ (由 Nitrosomonas 等菌種進行)
     • 硝化 (Nitrite oxidation to nitrate)：
       $2NO_2^- + O_2 \rightarrow 2NO_3^-$ (由 Nitrobacter 等菌種進行)
   • 總反應式（可寫成一步）：
     $NH_4^+ + 2O_2 \rightarrow NO_3^- + H_2O + 2H^+$

2. 反硝化作用 (Denitrification)：

   • 定義：在缺氧或厭氧條件下，利用有機物作為電子供體，將硝酸鹽 ($NO_3^-$) 或亞硝酸鹽 ($NO_2^-$) 還原為氮氣 ($N_2$)。
   • 化學方程式：
     • 以有機物為電子供體 (如葡萄糖)：
       $2NO_3^- + C_6H_{12}O_6 \rightarrow N_2 + 6CO_2 + 6H_2O$ (主要產物為 $N_2$)
     • 若以醋酸為電子供體：
       $2NO_3^- + 2CH_3COOH \rightarrow N_2 + 2CO_2 + 2H_2O + 2OH^-$

本題考查分子生物學技術中的定量聚合酶鏈鎖反應 (qPCR)，要求說明其操作流程與定量原理。qPCR 是一種強大的技術，用於同時擴增 DNA 或 RNA 並實時定量其起始量。

qPCR 的操作與定量原理

定量聚合酶鏈鎖反應 (qPCR)，也稱為實時 PCR (Real-time PCR)，是一種在 PCR 擴增過程中實時監測目標核酸產物量的技術。其核心在於將核酸產物的增加與可偵測的信號（通常是螢光）聯繫起來。

操作流程 (Steps)：

1. 樣品準備：

   • DNA 模板：提取總 DNA，作為 PCR 的起始模板。
   • RNA 模板：如果需要定量 RNA，則需先進行逆轉錄 (Reverse Transcription) 轉化為 cDNA (互補 DNA)，然後以 cDNA 作為模板進行 qPCR。
   • 引物 (Primers)：設計特異性結合於目標 DNA 序列的引物對。
   • 螢光染料或探針 (Fluorescent Dyes or Probes)：
     • SYBR Green 染料：一種結合於雙鏈 DNA (dsDNA) 的螢光染料。當 SYBR Green 與 dsDNA 結合時，會發出螢光。
     • TaqMan 探針 (或通用探針)：一種特異性結合於目標 DNA 序列的寡核苷酸探針，其兩端分別帶有螢光報告基團 (reporter dye) 和淬滅基團 (quencher dye)。在延伸階段，Taq 酶的 5'→3' 核酸外切酶活性會切斷探針，使報告基團和淬滅基團分離，從而釋放出螢光信號。
   • PCR 緩衝液、dNTPs、Taq 聚合酶：標準的 PCR 試劑。

2. 反應體系配置：將模板 DNA、引物、螢光染料/探針、dNTPs、Taq 酶和緩衝液混合在 PCR 反應管或盤中。

3. PCR 循環：將反應體系放入 qPCR 儀器中進行熱循環。每個 PCR 循環包括：

   • 變性 (Denaturation)：高溫 (約 94-95°C) 使雙鏈 DNA 分子解開，形成單鏈。
   • 退火 (Annealing)：降低溫度 (約 50-65°C)，使引物能與模板 DNA 上的互補序列結合。
   • 延伸 (Extension)：提高溫度 (約 72°C)，Taq 聚合酶以引物為起始點，沿著模板 DNA 合成新的 DNA 鏈。

4. 實時螢光信號檢測：在延伸階段（或某些儀器在退火階段），qPCR 儀器會激發螢光，並檢測反應體系發出的螢光信號。每進行一個循環，目標 DNA 產物增加一倍，與之結合的螢光染料/探針量也相應增加，螢光信號隨之增強。

定量原理 (Principle of Quantification)：

qPCR 的定量是基於螢光信號的增長曲線。

1. 螢光信號的閾值 (Threshold)：在 PCR 循環過程中，螢光信號會隨著 PCR 產物的增加而呈指數級增長。當螢光信號的增長率超過背景噪音時，儀器會設定一個「閾值線」。
2. 閾值循環數 (Threshold Cycle, Ct 值)：目標 DNA 產物量達到預設閾值線所需的 PCR 循環次數，稱為閾值循環數 (Ct 值)。